Chapter 18

The Blot Rolling Assay

A Method for Identifying Adhesion Molecules Mediating Binding Under Shear Conditions

Robert Sackstein and Robert Fuhlbrigge

© 2006 Humana Press Inc. 999 Riverview Drive, Suite 208 Totowa, New Jersey 07512

Summary

Adhesive interactions of cells with blood vessel walls under flow conditions are critical to a variety of processes, including hemostasis, leukocyte trafficking, tumor metastasis, and atherosclerosis. We have developed a new technique for the observation of binding interactions under shear, which we have termed the “blot rolling assay.” In this method, molecules in a complex mixture are resolved by gel electrophoresis and transferred to a membrane. This membrane can be rendered semitransparent and incorporated into a parallel-plate flow chamber apparatus. Cells or particles bearing adhesion proteins of interest are then introduced into the chamber under controlled flow, and their interactions with individual components of the immobilized substrates can be visualized in real time. The substrate molecules can be identified by staining with specific antibodies or by excising the relevant band(s) and performing mass spectrometry or microsequencing of the isolated material. Thus, this method allows for the identification, within a complex mixture and without previous isolation or purification, of both known and novel adhesion molecules capable of binding under shear conditions.

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western blotเป็นเทคนิคที่ใช้ดูการแสดงออกในระดับโปรตีน โดยใช้หลักการของgel electrophoresis ใช้แยกได้ทั้ง native protein และ denatured protein ต่อมาโปรตีนจะถูก transferไปยัง nitrocellulose membrane แล้วตรวจสอบโปรตีนที่ต้องการโดยใช้specific antibody

สำหรับขั้นตอนของการทำwestern blotคือ

1. เตรียมsample

สำหรับ cell line นั้น จะต้องถูกlyseก่อนโดยใช้ lysis buffer เพื่อทำลายผนังเซลล์ และแยกtotal proteinออกมา จากส่วนอื่นๆที่ไม่ต้องการ

2. gel electrophoresis

เป็นเทคนิคการแยกโปรตีนตามmolecular weight โดยgelที่ใช้ จะประกอบไปด้วย stacking geและseparation gel

stacking gel –> เป็นส่วนของgelชั้นบนสุด มีความละเอียดของgelต่ำ เพื่อทำให้โปรตีนทั้งหมดมารวมอยู่ ณ ที่เดียวกัน เพื่อที่จะได้เริ่มต้นจากจุดเดียวกัน

separating gel –> เป็นส่วนของgelที่ต่อจากstacking gel เป็นบริเวณที่ใช้แยกโปรตีนที่มีขนาดแตกต่างกันออกไป

3. Transfer

เป็นการย้ายโปรตีนจากgelไปยัง nitrocellulose membraneหรือPVDF membrane

4. Blocking

block nonspecific ด้วย 5%skim milk

5. Detection ด้วย primaryและsecondary antibody

Primary antibody เป็นantibodyที่specificต่อตัวโปรตีนของเรา

Secondary antibody เป็นantibodyที่specificต่อprimary antibodyอีกที (เพื่อความspecificและเพื่อใช้ในการdetectตัวโปรตีนของเราด้วย)

6. Analysis

ทำได้หลายวิธีเช่น

-  Colorimetric detection

- Chemiluminescent detection

- Radioactive detection

- Fluorescent detection เป็นต้น

Dal blog “Sentieri della Medicina“, vi segnalo un post molto ricco che tratta le numerorissime applicazioni dell’immunologia alla medicina di laboratorio.

Ecco il link: http://sentieridellamedicina.blogspot.com/2009/06/briciole-di-medicina-7-puntata-tecniche.html

Aparece el VIH

Saúl sabía sobre el VIH, no era algo que no entendiera: “Yo estaba en mi ruleta rusa cada tercer día, todas las semanas”; hasta que llegó lo inevitable, la sombra del VIH se convirtió en realidad.

Estaba con una persona, en septiembre del año pasado lo dejó de ver, al poco tiempo esa persona lo llamó y le dijo que tenía VIH: “No me asustó, pero me hice la prueba en noviembre y salió negativa; decidí hacerla meses después y volvió a ser el mismo resultado, pero me empecé a enfermar; de hecho desde hace cuatro años tengo un padecimiento de anginas, además de que tenía dudas por la vida que llevaba.

“Las pruebas me las hice en laboratorios “patito”, uno de ellos ya no existe; empecé con diarrea que se prolongó hasta agosto de este año, adelgacé, llegué a pesar 53 kilos, cuando pesaba 68. Caí en cama, estuve con suero tres días, acudí al médico por una infección estomacal; los médicos no entendían; me mandaron a hacer la prueba de VIH y salió positiva”. También padece diabetes y un pequeño tumor en la cabeza.

Su caso es un tanto alarmante, pues él sabía sobre las pruebas, se las comenzó a realizar hace siete años; de ahí se la hizo tres años después, en ese lapso las parejas sexuales ya eran demasiadas. Hasta que le dicen que una de sus parejas estaba infectada, se hace otras dos que fueron negativas, y cuando le hacen los estudios correspondientes, viendo su estado, su desgaste y el tipo de vida que llevaba, determinan que aproximadamente tiene con el VIH cuatros años; ya es SIDA.

Saúl se realizó las pruebas en laboratorios privados porque desconfiaba de las instituciones públicas, “eso no fue bueno, porque en los privados no había especialistas, desde la terapia notas un cambio”. El sector público muestra buenas opciones en consejería y seguridad en las pruebas. El caso de Saúl es una muestra de que si una de sus pruebas hubiera arrojado el resultado correcto, su estado de salud sería mejor.

El tratamiento

Su tratamiento consta de dos pastillas que debe tomar de por vida;los rascos se los dan gratis, aunque su costo es de cerca de los 15mil pesos. El lugar donde se atiende es un Capasits (Centros Ambulatorios de Prevención y Atención en Sida e Infecciones de Transmisión Sexual). El proceso ha sido rápido, de inmediato le hicieron la prueba Western Blot que salió positiva, le controlaron sus malestares y debe tomar además medicamentos para la diarrea, gripe, entre otras (esos corren por su cuenta).

Al momento de sus análisis que realizó en el INER (Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias) sobre las defensas y carga viral, “lo que los doctores llaman CD4″. El resultado fue que estaba al 12% de sus defensas, “el doctor no creía que pudiera estar en pie con esos resultados, lo que tengo ya es SIDA, y sólo debo seguir las indicaciones y no dejar de tomar las pastillas, porque si no el virus en 24 horas se reproduce 4 veces más.” Tiene dos meses que le dieron el resultado, el tratamiento durará el tiempo necesario; anexo a esto debe cumplir con pláticas y talleres que son obligatorios.

Mañana la última parte

Este post es el texto que ganó la Mención Honorífica en el Primer Concurso de Periodismo “Hazte la Prueba”.

La primera experiencia con la prueba de detección del VIH está llena de miedos, sensaciones, incertidumbre; ¿te la has hecho?

El VIH es el Virus de Inmunodeficiencia Humana, el cual ataca el sistema inmunológico; su detección se realiza por medio de las pruebas de detección de VIH, entre las que se encuentran la ELISA y la Western Blot (confirmatoria). Se recomiendan una vez al año; si se tienen prácticas de riesgo, dejar pasar 3 meses (periodo de ventana) y hacerse la prueba; también existen pruebas rápidas.

Hay cierto desconocimiento de las pruebas de detección, sobre todo para los que no se la han realizado nunca. Ya hemos comentado sobre ellas, sin embargo, es conveniente aclarar dudas, sobre todo a las relativamente nuevas y un tanto desconocidas pruebas rápidas.

El psicólogo de Ave de México A.C, José Luis Yebra, quien da consejería en dicha asociación donde realizan pruebas rápidas nos explica:

“Las pruebas rápidas surgen con la idea de que todos pudieran hacérsela e ir por ella a la farmacia, pero esto implicaba muchas cosas en contra, por lo que se decidió que se hicieran en dependencias, con consejería y todos los requisitos.” Tiene cerca de año y medio que la Secretaría de Salud aprobó las pruebas y en Centros de Salud la realizan.

¿En qué consiste la prueba rápida?

Esta prueba consiste “en un raspado en la boca, que se hace con una “pala” especial que tiene un papel absorbente, con el fin de detectar células y meterlas en un reactivo que detecta los anticuerpos. La respuesta se tiene en 15 minutos y su efectividad es de 99.6%.”

Una de las principales dudas respecto a estas pruebas es la efectividad, la cual no es mucho menor que la de la ELISA (99.9%), una de sus ventajas es que el resultado se obtiene en minutos, “lo que aminora la angustia; si sale con resultado “reactivo” (positivo), se realiza la prueba comprobatoria (Western Blot) y si sale “no reactivo” (negativo) se procede a las recomendaciones, tratamiento, entre otras cosas.”

“Cuando entra un virus se producen anticuerpos, los del VIH son muy específicos, la sangre es donde hay más células de ahí que la ELISA tenga un poco más de efectividad; en el caso de la prueba rápida se hace el raspado en un área específica de la boca donde se producen mas células; en pocas palabras, las dos pruebas buscan lo mismo, sólo la captación es diferente”.

La prueba rápida es totalmente recomendable, además de práctica, no dura más de 40 minutos con todo y el resultado, lo que la pone en un buen nivel, sobre todo para los que son muy desesperados. Los únicos requisitos para realizarla es que no se padezca de alguna enfermedad viral como la gripa y que no se estén tomando antibióticos.

La importancia de la consejería

La consejería es un aspecto importante a la hora de realizarse una prueba de detección, de hecho es casi un requisito adquirirla, ya que de ella puede depender el cómo se tome el resultado, cómo se afronte la situación y sobre todo la información que se debe tener.

El sexólogo César Pérez del Imesex nos comenta:

“Los factores de la importancia de la consejería son muchos; se debe checar si existe la posibilidad real de riesgo de infección de VIH, si hay factibilidad de un resultado positivo o negativo; es importante saber qué tipo de información tiene el paciente, si es verídica o son mitos, ya que esto repercute en el impacto del resultado.”

También es importante saber qué haría en caso de un resultado positivo, si tiene recursos económicos, amistades a quienes acudir, pues es un trance muy complicado; “en los 80´s la gente no sabía qué onda, no sabía leer un resultado, si veía positivo creía que estaba bien; las personas se suicidaban pues creían que se iban a morir al poco tiempo.”

En las dependencias donde se realizan las pruebas es importante que se realice la consejería antes y después del resultado. Siempre como apoyo y con el fin de orientar al paciente. Si no te la dan, solicítala, no esta de más que te informes sobre el tema, para evitar situaciones erróneas y malos entendidos. De una buena consejería puede depender estar angustiado o sentirte seguro.

Puede llevar varios minutos, debe hacerse en un lugar apropiado y siempre en confianza; “la persona que la realiza no debe jamás juzgar al paciente, ni por sus prácticas de riesgo, ni preferencias”; siempre deben informarte sobre lo que viene después de la prueba, sea tu resultado negativo o positivo; recomendaciones sobre el nivel de vida, evitar situaciones de riesgo; si tienes familia cómo sobrellevarlo; y saber que si es negativo no significa que en un futuro no puedas infectarte, entre otras cosas.

“Mi experiencia con la prueba de VIH”

Siempre he creído que la vida sexual de cada uno es algo íntimo, y que depende de cada quien el cómo vive su sexualidad, pero a veces por amor, desinformación, se accede a tener relaciones sin protección, lo que sin duda nos pone en un riesgo que parece intangible.

Hace unos años inicié mi vida sexual, en aquellos años la información que poseía era muy básica, tanto sobre infecciones de transmisión sexual, incluido el VIH, como de embarazos y métodos de anticoncepción. En mi caso tuve relaciones sexuales sin protección porque confíaba en mí y mi pareja sentimental, creía que si estabas sólo con alguien, no se corría ningún riesgo; hoy sé que nada es seguro.

Ahora, muchos años después, decido hacerme la prueba de detección de VIH, en mi vida me la había hecho, poco a poco me he ido informando y creando conciencia sobre su importancia, pero el miedo es una de las cosas por las que mucha gente no se la realiza, aún sabiendo que con ella pueden estar tranquilos si es un resultado que no ponga en peligro nuestra vida y además de que permite saber que no se está exponiendo la de una tercera persona.

Fui acompañado por una amiga, de verdad creo que ir con alguien aminora un poco el momento, llegamos a la Clínica Condesa, iba por la prueba rápida, pero no había, así que la ELISA era la disponible. Pasé primeramente a consejería, donde una doctora me hizo preguntas que tienen como fin tener el perfil, saber el porqué estaba ahí. Preguntan edad de inicio de vida sexual, número de parejas, entre otras cosas.

¿Qué harías si tu resultado es positivo?, menuda pregunta, respondí con un “no sé”, y de verdad no lo sabía. Si era negativo pues la protección al 100% era mi respuesta, pero al contrario no tenía la menor idea.

Pasé al laboratorio, en las sillas de espera había un hombre, adentro otro (es raro ver mujeres en las pruebas); me sacaron una muestra de sangre y tenía que pasar tres días después por mi resultado. Fui de nuevo acompañado, siempre hay una sensación de seguridad, pero la sombra de la duda no se va hasta que ves el resultado.

Las manos me sudaban, el corazón latía más fuerte; “pase por favor”, me dijeron; así lo hice. Firme de recibido con la mano temblorosa, me lo dieron y el resultado…negativo. No tienen idea de cómo cambia el semblante, el nerviosismo se había ido, el sudor se secaba, la tranquilidad regresó a mi vida.

Cinco pruebas, todas negativas

Víctor Contreras es un joven de 27 años, declarado homosexual y que vive hasta ahora su sexualidad plenamente; su caso puede ser el de muchos, un chavo al que le gusta trabajar, estar con su pareja y vivir la vida.

Sin afán de criticar o enjuiciar, debemos decir que es una persona que gusta del sexo sin condón; es lo que a él le satisface, conoce el riesgo que implica, pero después de cinco pruebas y todas negativas, “uno se cree más seguro”.

Su primera prueba fue en la antes llamada CONASIDA, “fue después de terminar una relación con un exnovio, el cual había sido muy promiscuo antes de estar conmigo, duramos seis meses.” Él tenía conocimientos básicos del VIH, incluido el riesgo latente, “en mi caso la edad influyó, cuando eres joven no crees que te pueda pasar algo malo.”

En ese entonces aún tenía un poco de temor ante el contacto sexual con gente que no conocía, era tímido, esto fue cambiando con el tiempo. “Siempre empezaba con mis parejas estables teniendo relaciones con condón y después sin él; en general no le vieron mayor problema, al inicio sí, pero era más bien incertidumbre, pues no sabían qué onda; al final accedían.” Ha tenido 7 parejas sentimentales estables; de las ocasionales ya perdió la cuenta.

Llegó a tener relaciones ocasionales sin condón, “si no había no importaba, a veces era por ganas, a veces desistí; era como no dejar pasar la oportunidad de tener una relación con determinado prototipo.”

La primera prueba llegó con un poco de miedo, y era también un aliciente hacérsela y saber que estaba bien para poder iniciar una nueva relación y tener prácticas sin condón. En aquel entonces en CONASIDA se decía que si estabas bien no volvían a hacer la prueba, pues el objetivo era crear conciencia. Su resultado fue un mes después, días que transcurrieron de lo más normal. “Cuando fui no me dio tanto miedo, tenía la seguridad de que estaba bien; pensé en la posibilidad de un resultado positivo, pero creí que era capaz de sobrellevarlo y asimilarlo”. El resultado fue negativo.

Su segunda prueba llegó un año después, en CONASIDA, a pesar de que le habían dicho que no habría segunda prueba. “La primera incertidumbre fue porque me dijeron que no podía regresar, pero fue en otra clínica; el sentimiento fue el mismo, creo que hasta tenía más confianza, conocí más de la vida de mi entonces pareja y sabía que no había riesgo; lo hice por control.”

Las dos siguientes fueron en el seguro social, la primera de ellas por un quiste que tenía en un testículo; “eso me causó conflicto, el pensar en muchas situaciones, el alto riesgo del virus; esa vez yo la solicité; me regañaron en el seguro. Ahí sí sentí miedo, aunque creía en la fuerza física y psicológica. En este caso no hubo consejería posterior, fui al mes y los revisé, fue negativo.”

La otra llegó porque durante su relación estable fue infiel, y estas relaciones ocasionales eran lo mismo con condón que sin él, “a mi anterior pareja ya no le fui fiel, me entró el remordimiento de no sólo ser yo, sino de poder contagiar a otra persona por mis actos. Terminé la relación y me sentí en un confort, aunque las dudas seguían, me la hice y salió negativa; aunque bajé de peso porque el quiste regresó, me enfermaba de gripa, dolores de espalda, pero hasta ese día todo bien.”

La más reciente, la quinta, fue en diciembre del año pasado, porque estaba en una relación nueva y al parecer su pareja no era como las demás. “Esta persona es distinta a las anteriores, además de que hay una diferencia de edad más marcada, por lo que me siento responsable de si algo malo pasa; pasé por relaciones de riesgo en el periodo de mi última relación y la actual, por lo que la incertidumbre era mucha; esa ocasión no quería abrir los resultados”.

De nuevo salió negativa, es sin duda un volado, es jugar a la ruleta rusa en cada relación, la incertidumbre y el miedo no es nada comparado con lo que se vive cuando se tiene el VIH.

“Cambiar mi tipo de relaciones es complicado, creo en que si estás con alguien estable, que es tu pareja, no hay porque perder la confianza; no me ha tocado y sé que las posibilidades se van agotando”.

I chose to wait to write about this incident, for obvious reasons….

Being that my donor was a substance abuser, that put me in the “high risk” category for a blood-borne disease such as Hepatitis C and HIV. They tested the donor thoroughly, but there still is a small “window” between infection and being able to pick it up on testing.

Everything was going well until September, when I was due for my routine HIV and Hep C testing. I had it done the day before, and when the Transplant Coordinator entered the room, I immediately knew something was wrong, and when she laid a lab slip next to me for more HIV testing (which I had done the day before), I figured something was REALLY wrong.

It turns out that the wrong test was ordered. Instead of a HIV 1 and 2 antibody, they ordered a Western Blot. As was explained to me, the Western Blot checks for 6 different HIV antibodies. 0 is negative, 1-2 is indeterminate, and 3-6 is positive for HIV. Wouldn’t you know, I had 1 antibody. I was fit in that day to see the Infectious Disease doc because the surgeon wanted reassurance for me (and him) that it wasn’t an issue. The first thing the ID doc said to me was that he didn’t know why I was there for an appointment because it was a big nothing. I was 20 weeks post-transplant, and indeterminate Western Blots are not all that uncommon. Sometimes a person is indeterminate the one time, and the next time is negative; sometimes they continue with an antibody or 2. But the window for infection is predominately within 6 weeks, so he felt it was nothing. They did the correct test that day, and I was negative.

I was tested again 2 days ago, and continue to be negative (for both Hep C and HIV). The surgeon told me at my appointment that due to the profound immunosuppression right after transplant, should the kidney have been HIV+, I would have developed HIV shortly after. Yes, it was a stressful time….

My theory of last month was validated: after 1 month of being off Dapsone and Valcyte, my hemoglobin is up more than 2 GRAMS; I was 11.5, and this week was 13.6! So it must have been either or both meds causing the anemia. No more Procrit, which is good.

I’ll still be getting monthly labs, but my next appt is 2 months, rather than 1, so things are always getting better.

The only downside lately is that I’ve been getting mild to moderate flank pain. No doubt cyst pain from my “native” kidneys, and not much to do about it, unless they get infected. I hope they shrivel up soon and fade away, as they most likely will do….

It has been said that “HIV” tests are “99.8% accurate”. How is it then that some say that winetasting is less subjective? Prominent Rethinker David Crowe of ARAS has done the work, & as usual goes straight to the horse’s mouth: in this case, examining the actual package inserts included with popular “HIV” test kits. Here are the relevant passages (verbatim). The careful legalistic phrasing in every package insert reveals the manufacturers are aware of the non-specificity of their tests, & are carefully pre-empting future litigation. 

Manufacturer Disclaimers by David Crowe 

The fine print on the information provided with HIV test kits can be very revealing for its warnings about limitations of the tests.

“A Reactive result indicates that HIV-1 RNA was detected. For a specimen that is repeatedly reactive on an HIV-1 antibody test and reactive in the APTIMA HIV-1 RNA Qualitative Assay, the individual is considered confirmed infected with HIV-1…A specimen that is reactive in the APTIMA HIV-1 RNA Qualitative Assay but that has not been tested in an HIV-1 antibody test should be further tested using a licensed test for HIV-1 antibodies.”

Aptima HIV-1 RNA qualitative assay. Gen-Probe. 2006 Oct
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/6983-AptimaHIV-1RNAQualitativeAssay.pdf

“Clinical data has not been collected to demonstrate the performance of the OraQuick ADVANCE Rapid HIV-1/2 Antibody Test in persons under 12 years of age. A reactive test…suggests the presence of HIV-1 and/or HIV-2 antibodies…[this test] is intended as an aid in the diagnosis of infection with HIV-1 and/or HIV-2. AIDS and AIDS-related conditions are clinical syndromes and their diagnosis can only be established clinically. For a reactive result, the intensity of the test line does not necessarily correlate with the titer [amount] of antibody in the specimen…A person who has antibodies to HIV-1 or HIV-2 is presumed to be infected with the virus, except that a person who has participated in an HIV vaccine study may develop antibodies to the vaccine and may or may not be infected with HIV.”

OraQuick Advance rapid HIV-1/2 antibody test. OraSure. 2005 Apr
http://www.orasure.com/uploaded/398.pdf

“A person who has antibodies to HIV-1 is presumed[!] to be infected with the virus, except that a person who has participated in an HIV vaccine study may develop antibodies to the vaccine and may or may not be infected with HIV. Clinical correlation is indicated with appropriate counseling, medical evaluation and possibly additional testing to decide whether a diagnosis of HIV infection is accurate…Reactivity at or only slightly above the Cutoff Value is more frequently nonspecific, especially in samples obtained from persons at low risk for HIV infection…At present, there is no recognized standard for establishing the presence or absence of antibodies to HIV-1 and HIV-2 in human blood…Specificity is based on assay of blood donations from random donors [under the assumption that any positive result would be a false positive, yet when this test is used under normal circumstances such a positive would be treated as a true positive]…Specificity based on an assumed zero prevalence of antibody to HIV-1 and/or HIV-2 in random donors (17037 out of 17054) is estimated to be 99.90%…[but] in these calculations, one sample of the eighteen total repeatedly reactive specimens was confirmed by Western Blot and has been excluded.”

Human immunodeficiency virus types 1 and 2: (E. coli, B. megaterium, recombinant antigen) HIVAB HIV-1/HIV-2 (rDNA) EIA. Abbott Laboratories. 2004
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/5017-Abbott-EIA.pdf

“A reactive result by Uni-Gold Recombigen HIV [test] suggests the presence of anti-HIV-1 antibodies in the specimen. Uni-Gold Recombigen HIV is intended as an aid in the diagnosis of infection with HIV-1. AIDS and AIDS-related conditions are clinical symptoms and their diagnosis can only be established clinically.”

Uni-Gold Recombigen HIV label. Trinity biotech. 2004 Jan
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3154-UniGoldRapid.pdf

“Uni-Gold™ Recombigen® HIV is a single use rapid test, for the detection of antibodies to HIV-1 in plasma, serum and whole blood (venipuncture). Uni-Gold™ Recombigen® HIV is intended for use in point of care settings as an aid in diagnosis of infection with HIV-1…Immunosuppressed or immunocompromised indiv iduals infected with HIV-1 may not produce antibodies to the virus…A Reactive result by Uni-Gold Recombigen® HIV suggests[!] the presence of anti-HIV- 1 antibodies in the specimen. Uni-Gold Recombigen® HIV is intended as an aid in the diagnosis of infection with HIV-1. AIDS and AIDS-related conditions are clinical symptoms and their diagnosis can only be established clinically…”

Uni-Gold Recombigen HIV Control: Summary of safety and effectiveness. Trinity biotech. 2003 Dec
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3156-UniGoldSafetyEff.pdf

“The overall specificity of the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test for serum specimens in these studies was calculated to be 3608/3639 = 99.1%, combining the number of Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test Non-Reactive results obtained from the study of previously screened HIV -1 antibody negative serum specimens with the number of Reveal™ Rapid HIV-1 Antibody Test Non-Reactive results obtained from the studies of high-risk populations [i.e. 1% false positives if we can assume that other antibody tests (ELISA and Western Blot) are 100% accurate and also completely independent from this rapid test]…The overall specificity of the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test for plasma [i.e. blood] specimens in these studies was calculated to be 2970/3011 = 98.6% [i.e. 1.4% of tests false positive] combining the number of Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test Non-Reactive results obtained from the study of previously screened HIV -1 antibody negative plasma specimens with the number of Reveal™ Non-Reactive results obtained from the studies of low -risk populations [with the same caveats]…LIMITATIONS OF THE TEST…6. Limited studies were conducted to determine the potential effect of interfering substances and unrelated medical conditions on the performance of the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test. 7. The specificity of the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test for serum specimens in low -risk populations has not been evaluated. 8. Limited studies were conducted to determine the performance of the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test on fresh serum and plasma specimens. 9. A Reactive test result using the Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test suggests the presence of anti-HIV-1 antibodies in the specimen. The Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test is intended to be used as an aid in the diagnosis of infection with HIV -1. AIDS and AIDS-related conditions are clinical syndromes and their diagnosis can only be established clinically. Results of the MedMira Reveal™ Rapid HIV -1 Antibody Test should not be used in isolation, but in conjunction with the clinical status, history, and risk factors of the individual being tested. 10. The intensity of the red dot (Reactive test result) does not necessarily correlate with the antibody titre [amount] of the specimen.”

Reveal rapid HIV-1 antibody test. MedMira. 2003 Dec 4
http://www.fda.gov/cber/pmalabel/P000023LB.pdf

“The VERSANT HIV-1 RNA 3.0 Assay (bDNA) is not intended for use as a screening assay for HIV infection or as a diagnostic test to confirm the diagnosis of HIV infection”

Summary of Safety and Effectiveness – Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay. Versant. 2003 Jul 9
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3152-VersantRNA.pdf

“nonspecific reactions may occasionally be seen in specimens from people who have prior pregnancy, blood transfusion, or exposure to human cells or media containing cultured HIV antigen. Because of these and other potential nonspecific reactions, specimens reactive with the Vironostika HIV-1 Plus O Microelisa System assay should be confirmed with a confirmatory test ,e.g., Western Blot testing…antibody. In individuals at increased risk of infection, such as homosexual men, hemophiliacs, or intravenous drug users, repeatedly reactive specimens are usually found to contain antibodies to HIV by additional, more specific tests. However, when the ELISA is used to screen populations with a low prevalence of HIV infections, nonspecific reactions may be more common than specific reaction…Specimens found repeatedly reactive by ELISA and positive by additional, more specific tests are considered positive for antibodies to HIV-1. Clinical correlation is indicated with appropriate counseling, medical evaluation and possibly additional testing to decide whether a diagnosis of HIV infection is accurate.”

Vironostika HIV-1 plus O microelisa system. Biomérieux. 2003 Jun 5
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3150-VironostikaEIA.pdf

“A Reactive result using the OraQuick® Rapid HIV-1 Antibody Test suggests the presence of anti-HIV-1 antibodies in the specimen. The OraQuick® Rapid HIV-1 Antibody Test is intended as an aid in the diagnosis of infection with HIV-1. AIDS and AIDS-related conditions are clinical syndromes and their diagnosis can only be established clinically. For a Reactive result, the intensity of the test line does not necessarily correlate with the titer of antibody in the specimen. A Non-Reactive result does not preclude the possibility of exposure to HIV or infection with HIV. An antibody response to recent exposure may take several months to reach detectable levels.”

Detection of HIV-1 antibodies in fingerstick whole blood specimens. OraSure. 2002 Nov 7
http://aras.ab.ca/articles/corporate/OraQuickTestLabel.pdf

“The NucliSens HIV-1 QT assay is not intended to be used as a screening test for HIV-1 nor is it to be used as a diagnostic test to confirm the presence of HIV-1 infection.”

NucliSens HIV-1 QT. Organon Teknika. 2001 Nov 13
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3153-NucliSens-NASBA.pdf

“The AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test is an in vitro nucleic acid amplification test for the quantitation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) RNA in human plasma…[It] is not intended to be used as a screening test for HIV or as a diagnostic test to confirm the presence of HIV infection…Quantitative culture has limited utility for monitoring virus levels in infected individuals since only a small fraction of virus particles is infectious in vitro. Infectious virus is often undetectable in asymptomatic individuals…The clinical specificity of the…test was determined by analysis of 495 anti-HIV-1 negative blood donors. None of these specimens was reactive…Assuming[!] a zero prevalence of HIV-1 infection in the seronegative blood donors, the specificity of the test was 100%”

Amplicor HIV-1 Monitor Test. Roche. 1999
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/379-Amplicor.pdf

“Although nonspecific reactvity [false positives] may sometimes be attributed to autoantibodies, it is possible that in some cases the pattern may represent a cross-reaction with another human retrovirus…POSITIVE blot results using any specimen type (serum, plama, or urine) should be followed with additional testing. Such testing may rely on alternative test methods or specimen types. [yet this is a 'confirmatory test'!]…[Table P shows that 1 out of 63 tests on pregnant women who were HIV ELISA negative was positive on western blot]

[Table A of this test kit label shows that 168 out of 364 people (75%) classified as low risk had at least one of 8 bands positive, but only 126 people were eventually classified as positive. Out of the 75% with at least one positive band only 54% had a p17 band while 79% had gp120/160. Amongst people with AIDS while 100% had a gp41 band and 98% had a gp120/160 band, only 21% had p17 and only 42% had p55]

[Table B of this test kit label shows that of 278 Low Risk people with a positive ELISA antibody test, 123 had negative Western Blots (44%), 29 indeterminate (11%) and 126 positive (45%). Of 86 people classified as low risk with consistently negative ELISA tests 73 (85%) were western blot negative, 13 (15%) were indeterminate and 0 were positive.]

Persons demonstrating antibodies to HIV-1 should be referred for medical evaluation, which may include testing by other techniques…Accurate diagnosis of HIV-1 infection is important in determining an individual’s risk for developing AIDS. Accuracy is complicated by false-positive and false-negative (EIA) results…Slight ambiguities exist in the designation of the molecular weights of the HIV-1 antigens [used in this test]…Although a [Western] blot POSITIVE for antibodies to HIV-1 indicates infection with the virus, a diagnosis of Acquired Immundeficiency Syndrome or AIDS can only be made clinically if a person meets the case definition of AIDS established by the CDC. POSITIVE blot results using any specimen type (serum, plasma, or urine) should be followed with additional testing [even though the Western Blot test is usually claimed to be a 'confirmatory' test]…The clinical implications of antibodies to HIV-1 in an asymptomatic person are not known. However, a larger proportion of such persons have virus detectable in their peripheral blood and some will develop immunodeficiency. INDETERMINATE blots should not be used as the basis for diagnosis of HIV-1 infection…A negative blot does not exclude the possibility of infection with HIV-1.”

Human Immundeficiency Virus type 1 (HIV-1) Western Blot kit. Cambridge Biotech. 1998 Jun 2
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3149-CambridgeHIVUrine.pdf

“In order to afford maximum protection of the blood supply, the Genetic Systems rLAV EIA [ELISA] was designed to be extremely sensitive. As a result, non-specific reactions may be seen in samples form some people who, due to prior pregnancy, blood transfusion, or other exposure, have antibodies to the human cells or media in which the HIV-1 virus used for the manufacture of the Genetic Systems rLAV EIA is grown…when the EIA is used to screen population in which the prevalence of infection with HIV-1 is low (e.g., blood donors), nonspecific reactions may be more common.”

Summary basis of approval: Genetic Systems rLAV EIA. Genetic Systems. 1998 Mar
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/3151-GenSysEIA.pdf

“”both the degree of risk for HIV-1 infection of the person studied and the degree of reactivity of the serum may be of value in interpreting the test”

“the EIA [this test] was designed to be extremely sensitive. As a result, non-specific reactions may be seen in samples from some people who, for example, due to prior pregnancy, blood transfusion, or other exposure, have antibodies to the human cells or media in which the HIV-1 is grown for manufacturer of the EIA. The risk of an asymptomatic person with a repeatably reactive serum sample developing AIDS or an AIDS-related condition is not known.”

“At present there is no recognized standard for establishing the presence and absence of HIV-1 antibody in human blood.””

Human Immunodeficiency Virus Type 1 HIVAB HIV-1 EIA. Abbott Laboratories. 1997 Jan
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/377-AbbottEIA.pdf 

“Not all persons infected with HIV-1 will test positive; not all persons testing positive are infected with HIV-1…inaccurate results may occur and a positive test result alone does not mean I have AIDS or will ever develop AIDS…an indeterminate result means the result is neither negative nor positive”

Home access HIV-1 test system. Home Access Health Corp.. 1996 May
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/4825-HomeAccessHIVTest.pdf

“The possibility of exposure to or infection with HIV cannot be excluded by a negative [Coulter HIV-1 antigen] test result.”

Antibody to Human Immunodeficiency Virus type 1 (human); HIV-1 p24 antigen neutralization kit. Coulter. 1996 Apr
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/2403-Coulter-p24.pdf

“AIDS and AIDS-related conditions are syndromes that can only be established by clinical diagnosis…The possibility of exposure to or infection with HIV cannot be excluded by a negative [Coulter HIV-1 antigen] test result…False positive results may occur due to non-specific binding to assay materials and not from infection with HIV-1…Based on an assumed 100% prevalence [of HIV] in antibody positive individuals, the sensitivity of the neutralization test was 99.5% (855/859) for repeatedly reactive specimens with a valid neutralization test and 100% (855/855) for specimens that were stored and tested according to recommendations.”

Antibody to Human Immunodeficiency Virus type 1 (human); HIV-1 p24 antigen neutralization kit. Coulter. 1996 Apr
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/2403-Coulter-p24.pdf

“HIV-1 p24 antigen is present only transiently prior to seroconversion and later can be complexed by specific antibodies. HIV-1 p24 antigen testing should not be used in lieu of HIV-1 antibody testing as a screen for HIV-1 infection…The predictive value of a positive test is strongly influenced by the prevalence of HIV-1 infection in the population tested. For example, in low prevalence populations the predictive value was 11.1% (1/9) while in populations with known HIV-1 infection, the predictive value was 97.1% (395/407).”

Antibody to Human Immunodeficiency Virus type 1; HIVAG-1 Monoclonal. Abbott Laboratories. 1996 Apr
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/2402-AbbottAntigen.pdf

“False positive results [with this HIV-1 antigen test kit] may occur due to non-specific binding to assay materials, and not from infection with HIV-1”

Antibody to Human Immunodeficiency Virus type 1 p24 antigen (murine monoclonal). Coulter. 1996 Apr
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/2404-Coulter-p24-Murine.pdf

“When the EIA [enzyme immunoassay antibody test] is used to screen populations in which the prevalence of HIV-1 infection is low (e.g., blood donors), nonspecific reactions may be more common…Reactivity at only slightly above the cut-off value is more frequently nonspecific…A person who has antibodies to HIV-1 is presumed to be infected with the virus…The risk of an asymptomatic person with a repeatedly reactive serum sample developing AIDS or an AIDS-defining condition is not known.”

Human immunodeficiency virus type 1 HIVAB HIV-1 EIA. Abbott Laboratories. 1993
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/4188-AbbottEIA_1993.pdf

“In comparison with antibody testing, antigen testing will only detect approximately 50% of AIDS, 30% of ARC [AIDS Related Complex] and 10% of asymptomatic HIV infections…the predictive value of a positive test is strongly influenced by the prevalence of the condition in the population tested. In low risk populations, where the rate of HIV-1 infection may not exceed 0.1%, the rate of antigen positivity could be as low as 0.01%. Assuming a test sensitivity of 100%, the positive predictive value of a repeatably reactive test would be only 5.9%, i.e. only 6 tests per 100 would be true positives…The sensitivity and specificity of the HIVAG-1 blocking antibody procedure are not known…In clinical studies performed in low risk populations, the neutralization test was negative for 137/137 repeatedly reactive (presumed false reactive) samples giving a 95% confidence range for specificity of 97.8% to 100%…in known infected individuals [assuming the accuracy of antibody tests], the HIVAG-1 blocking antibody test was positive in 67/67 repeatedly reactive (presumed true positive) samples giving a 95% confidence range for sensitivity of 95.9% to 100%”

HIVAG-1; Antibody to Human Immunodeficiency Virus Type 1. Abbott Laboratories. 1989
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/2401-AbbottAntibody.pdf

“Manufacturers claim impressive levels of accuracy [of HIV tests] – usually well in excess of 99% – but much depends on the context in which the assays are being used, and any overall figure is likely to be misleading.”

Mortimer PP. The AIDS virus and the HIV test. Med Int. 1988;56:2334-9.

“Clinical samples have also been described have…been described that are reactive in the screening assays but do not contain HIV-1 antibody. Some of these samples possess antibody to certain Class II HLA histocompatibility antigens that are found in some cell lines used to produce the virus. Other persons, who have had no known exposure to HIV-1, produce reactive results in the screening test for still unknown reasons. Such nonspecific results are found commonly when screening tests are used in large populations. Since the psychosocial and medical implications of a positive antibody test may be devastating, it has been recommended that additional testing be performed on such samples [such as this test]…A sample that is reactive in both the EIA screening test and the Western blot is presumed [!] to be positive for antibody to HIV-1, indicating infection with this virus except in situations of passively acquired antibody or experimental vaccination…Sensitivity and specificity of the HIV-1 Western Blot Kit was determined in comparative studies with a previously licensed HIV-1 Western blot using EIA repeatedly reactive samples from high AIDS risk and low risk populations respectively [i.e. without a ‘gold standard’ such as virus purification] [Specificity can only be tested with EIA negative specimens, of which there were none].”

Human Immunodeficiency Virus Type 1 (HIV-1) HIV-1 Western Blot Kit. Epitope.
http://davidcrowe.ca/SciHealthEnv/papers/378-Epitope-WB.pdf

Let me start by saying that I’m a product of the Hildreth lab, so I am fairly well-versed in the trojan exosome hypothesis. Basically, the hypothesis, as presented by Drs. Hildreth and Gould, is that HIV particles are basically glorified exosomes. They postulate that the HIV budding machinery usurps the normal exosome budding machinery to produce virions. Accordingly, HIV virions are pretty similar to exosomes, except that they carry the viral payload. There are a number of lines of evidence that suggest this, most of them outlined in the PNAS hypothesis paper published about 5 years ago.

Now, there are a number of people who don’t believe this is the case—some of them pretty prominent. I’m not writing to either support or refute the exosome hypothesis, but rather to discuss a paper that came out of David Ott’s lab claiming to refute the trojan exosome hypothesis.

A number of groups have noticed that CD45 is missing in viral particles. This observation is part of the evidence for HIV budding from lipid rafts—although I don’t really believe lipid rafts exist; I am much more partial to tetraspanin enriched membranes. In any event, one way to get highly purified viral particles is to run supernatant from infected cells through a series of density gradients, take the pellet, and then deplete for CD45. This gets rid of contaminating vesicles that contain CD45, leaving purified viral particles. A number of groups claim that exosomes also do not contain CD45, which would mean that CD45 depletion would leave both exosomes and HIV particles. Lori Coren reposts in Retrovirology that depleting supernatant from Jurkat and SupT1 cells of CD45 removes exosomes, suggesting that HIV particles and exosomes differ in CD45 composition and, therefore, likely do not share the same budding process.

They really state their case with one figure, although it’s split into six parts. They isolated exosomes from the two cell lines, depleted half for CD45 and then blotted for CD45, actin and did silver stains for total protein. After depleting they observed no CD45, no actin, and I think no protein (I think they mislabeled part of the figure). They did the same thing for infected  cell lines, except that they also blotted for p24. They found pretty much the same thing, although actin shows up in the Jurkat/HIV supernatant that was CD45 depleted and you can see protein (mostly viral proteins) in the CD45 depleted samples. They claim that CD45 depletion leaves virus (we know that), but not exosomes. They claim that the reason other groups didn’t find CD45 in exosomes was because they were using anti-CD45 antibodies that don’t recognize the cytoplasmic domain of the protein, while they use a pan-CD45 antibody that will recognize more isoforms. I’m not sure how immunoprecipitating with antibodies that recognize the cytoplasmic domain of a protein will pull out intact vesicles, but with this paper, it’s beside the point.

Now, their findings may be true, but this paper has several flaws preventing me from accepting their conclusions. Anyone who has tried to isolate exosomes knows that it is a total pain in the ass. They are hard to define biochemically, which is why in almost every paper you see on exosomes, exosome presence is confirmed by electron microscopy. Based on this paper, we have no idea what this group is actually working with. You can’t show the depletion of exosomes if you don’t show that the exosomes are there in the first place. And there is no control for depletion using markers we know are on exosomes (like CD81) and markers that we know are excluded. I would be much more inclined to believe the results if they showed depletion using some unrelated antibody, like an anti-GFP, didn’t produce the same effect. How do we know that their immunoprecipitation itself didn’t affect the outcome? There’s no protein left after immunoprecipitation and it’s not like Jurkats and SupT1s pump out exosomes; they may just not have enough protein in their sample following depletion to detect by Western blot. And why don’t you blot for exosome markers while you are at it? If you are going to do biochemical analyses, at least do it thoroughly.

So, I think if they added some controls, this could be an interesting observation. As it is, it doesn’t clarify anything.

M. Linde

Um teste Western Blot positivo é prova de Infecção por HIV? de Papadopulos-Eleopulos E., Turner, V. F. & Papadimitriou, J. M. Bio/technology, 11, 696-707 (1993). “…não estamos simplesmente discutindo para ver quem vai prevalecer, mas presumo que devemos lutar pela verdade …” Philebus, os Diálogos de Platão Sumário É atualmente aceito que um teste Western blot (WB) positivo, seja um teste positivo para anticorpos HIV, o que é sinônimo de infecção por HIV e o risco consequente de desenvolver e morrer de AIDS. Nesta comunicação, apresentamos uma avaliação crítica dos dados atualmente disponíveis sobre o isolamento do HIV e a testagem de anticorpos. A evidência disponível indica que:

• (a) os testes de anticorpos não são padronizados;

• (b) os testes de anticorpo não são reproduzíveis;

• (c) as proteínas WB (bandas) que são consideradas serem codificadas ao genoma do HIV e serem específicas do HIV podem não ser codificadas pelo genoma do HIV e podem, de fato, representar proteínas celulares normais:

• (d) até mesmo se as proteínas sejam específicas do HIV, porque nenhum padrão ouro tem sido usado e pode até mesmo nem existir para determinar a especificidade, um WB positivo pode não representar nada mais que uma reatividade cruzada com muitos anticorpos não HIV presentes nos pacientes de AIDS e naqueles em risco, e portanto não serem relacionados com a presença de HIV.

Concluímos que o uso dos testes de anticorpos para o HIV como ferramenta diagnóstica e epidemiólogica para a infecção por HIV deve ser reavaliado. Introdução Até esta data, os únicos métodos rotineiramente usados para demonstrar a presença do HIV in vivo são os testes de anticorpos ELISA e WB [Western Blot]. No ELISA, a “proteínas HIV” estão presentes como uma mistura. No WB, as proteínas HIV são dissociadas e colocadas em uma placa de gel de policrilamida. Depois da eletroforese, que separa as proteínas pelo peso molecular e carga, as proteínas são transferidas para uma membrana de nitrocelulose por transposição desta membrana [electroblotting]. Na realização de ambos os testes, tanto no ELISA quanto no WB, o soro do paciente é adicionado a preparação do antígeno. É assumido que se os anticorpos HIV estiverem presentes, eles reagirão com as proteínas HIV as quais, depois de lavagem, são visualizadas por uma reação cromogênica de uma enzina imunoglobulina humana. No ELISA é lida oticamente. No WB, as proteínas individuais são reconhecidas e interpretadas visualmente como bandas coloridas, cada uma das quais é designada por um pequeno “p” (proteína), seguido por um número, [que é o peso molecular em kilodaltons], por exemplo, p41. É acreditado que o WB seja altamente sensível e específico, e um status positivo é visto como sinônimo da infecção HIV. Um status HIV positivo tem tais profundas e tão longas implicações que a ninguém deve ser exigido carregar um tal fardo sem garantias sólidas da veracidade do teste e de sua interpretação. Neste trabalho, a evolução dos testes de anticorpos, as bases de sua especificidade e a validade da sua interpretação são avaliados. A aceitação de um teste de anticorpos para HIV como sendo cientificamente válido e confiável requer o seguinte:

• (i) uma fonte dos antigenos específicos do HIV;

• (ii) padronização;

• (iii) determinação, da reprodutibilidade do teste .

Uma vez estes critérios tenham sido preenchidos, e antes da introdução dos testes de anticorpos na medicina clínica, a sensibilidade do teste, especificidade e valores previsíveis devem ser determinados pelo uso de um padrão ouro, o próprio HIV; Proteínas consideradas serem antígenos do HIV As proteínas consideradas representarem antígenos de HIV são obtidas de culturas mitogenicamente estimuladas, nas quais tecidos de pacientes de AIDS são co cultivados com células derivadas de pacientes que não tem AIDS, geralmente de linhagem de células leucêmicas estabelecidas. A seguir a detenção da enzima trnscriptase reversa (RT) nas culturas, o sobrenadante, e mais frequentemente lisados de células, são dilatados nos gradientes de densidade. O material que faz banda em 1.16 gm/ml é considerado representar “puro HIV” e consequentemente as proteínas encontradas nesta densidade são consideradas antigenos HIV. As proteínas imunogênicas do HIV são pensadas serem codificadas por três genes, chamados de GAG, POL e ENV. Os genes GAG codificam um precursor p53/55, que é então partido em p24/25 e p17/18. O gene POL codifica p31/32, e o gene ENV codifica a proteína percursora p160 que é partida em p120 e p41/p45. A proteína p120 A opinião geralmente aceita é que p120 e p41 são produtos da clivagem de p160, que é encontrada apenas nas células infectadas e não no vírus. Contudo: (a) p120 é um componente apenas das protuberâncias [espigas] na superfície das partículas HIV; (b) As protuberâncias só são encontradas nas partículas imaturas e não nas partículas maduras livres na célula ; (c) as particulas imaturas “são muito raramente observadas”. A despeito destes achados, quando o “HIV purificado” é testado contra o soro da AIDS, fortes bandas correspondendo a p120 e p160 se desenvolvem. A solução para estas contradições foi encontrada quando foi mostrado que p80 (vide infra) e “os componentes visualizados na região 120-160-kDa não correspondem a gp120 ou seu precursor mas muito mais representam oligômeros de gp41″. A proteína p41 p41 é uma das proteínas detectadas pelos grupos de Gallo e de Montagnier nos primeiros isolados do HIV. Contudo: (a) Montagnier e seus colegas observaram que o soro da AIDS reagia com a proteína p41 no HIV e no HTLV-I infectado bem como com células não infectadas, e concluiu que a banda p41 “pode ser devida a contaminação do vírus pela actina celular que está presente nos imunoprecipitados de todos os extratos celulares”. Embora o grupo de Gallo não tenha encontrado tal reação com p41 em células não infectadas, eles encontraram uma proteína p80 e concluíram que a reação não era “específica”; (b) Actina é uma proteína onipresente que é encontrada em todas as células, bem como em bactérias e virus. Retrovirus bem conhecidos, tais como o vírus do tumor mamário no rato e o vírus do sarcoma de Rous, também tem sido demonstrado apresentarem actina de origem celular e tem sido postulado que esta proteína tem um papel chave na reunião e germinação retroviral. É também conhecido que a oxidação celular dos grupos sulfidril, como nos casos dos pacientes de AIDS, está correlacionada com a reunião da actina polimerizada, e que o nível do anticorpo actina para fazer a ligação das células tem sido proposta “como um marcador sensível para linfócitos ativados”. (c) Placas sanguíneas de indivíduos saudáveis também contém uma proteína p41/45 que reage com o soro de homens homossexuais com AIDS e pacientes de púrpura trombocitopênica imune (ITP) o que “representa ligações não específicas da IgG à actina na preparação da placa sanguínea”. A proteína p32 Em 1987 Henderson isolou p30-32 e p34-36 de “HIV purificado por bandeamento duplo” em gradientes de densidade de sucrose. Ao comparar as sequências destes aminoácidos destas proteínas com a histocompatibilidade Classe II das proteínas DR, ele concluiu que ” “as cadeias DR alfa e beta pareceram idênticas às proteínas p34-36 e p30-32 respectivamente”. A proteína p24/25 A detecção de p24 atualmente é acreditada ser sinônimo de isolação e viremia do HIV. Contudo: (a) Separadamente de uma publicação conjunta com Montagnier onde eles afirmam que HIV p24 é único, Gallo e seus colegas tem repetidamente declarado que as p24s de HTLV-I e HIV imunologicamente apresentam reação cruzada; (b) Genesca et al realizaram estudos em 100 amostras negativas no ELISA de sadios doadores de sangue ; 20 foram encontrados terem bandas HIV que não preenchiam o critério deles (1989) usado pelos bancos de sangue para um positivo WB. Eles foram considerados como indeterminados para WB – (WBI) -, com p24 sendo a banda predominante, [70% dos casos]. Entre os recipientes do sangue WBI, 36% eram WBI 6 meses depois da transfusão, mas assim o eram 42% dos indivíduos que receberam amostras negativas para WB. Ambos, doadores e receptores de sangue, permaneceram saudáveis. Eles concluíriam que os padrões WBI “são excecivamente comuns em doadores selecionados aleatoriamenteb e receptores que não se correlacionam com a presença de HIV-1 ou a transmissão de HIV-1″, “a maioria de tais reações representa resultados falso positivos”; (c) Anticorpos para p24 tem sido detectados em 1 em cada 150 indivíduos saudáveis, 13% de pacientes considerados saudáveis e aleatóriamente selecionados que tem verrugas, 24% de pacientes com linfoma de células T e pródromo e 41% de pacientes com esclerose múltipla; (d) 97% do soro de homossexuais com ITP e 94% do soro de homosexuais com linfadenopatia ou AIDS contém um anticorpo que reage com um antígeno de membrana 25Kd encontrado em placas sanguíneas de doadores saudáveis e pacientes de AIDS, bem como um antígeno 25 Kd encontrado nas células dos rins do macaco verde. Esta reação estava usente no soro obtido de pacientes não homossexuais com ITP ou purpura trombocitopenica não imune; (e) Reciprocamente, o antígeno p24 não é encontrado em todos os HIV positivos ou até mesmo pacientes da AIDS. Em um estudo, a reação de cadeia de polimerase (PCR) e p24 foram usados para detectar HIV em pacientes em vários estágios estabelecidos pelo CDC desde assintomáticos até a AIDS. A p24 foi detectada em 24% dos pacientes e o HIV RNA em 50%; (f) Em outro estudo, “Metade dos casos nos quais um sujeito tinha um teste positivo para p24, o sujeito mais tarde teve um teste negativo sem tomar qualquer medicação, o que seria esperado afetar os níveis de antígeno p24. O teste é clinicamente errático e deve ser interpretado muito cautelosamente” A proteína p17/18 (a) Além da banda p24, a banda p17/18 é a banda mais frequentemente detectada no WB de doadores de sangue sadios; (b) Soro de pacientes de AIDS se atam a proteína p18 nas células T infectadas mitogenicamente estimuladas, mas não nos não infectados com linfócitos não estimulados. Contudo, quando os linfócitos são mitogenicamente estimulados, mas não infectados, o soro da AIDS se liga a proteína p18 nestes linfócitos não infectados; (c) Um anticorpo monoclonal (MCA) para HIV p18, reage com as células dendríticas nos tecidos linfáticos de uma variedade de pacientes com várias doenças não relacionadas a AIDS; e “o mesmo padrão de reatividade esteve presente no tecido normal retirado de indivíduos não infectados bem como naqueles retirados de sujeitos HIV positivos”; (d) Pacientes de AIDS e aqueles em risco tem alto níveis de anticorpos da proteína onipresente miosina, a qual tem duas sub unidades de pesos moleculares 18.000 e 25.000. Em vista de toda a evidência supramencionada, é difícil defender a opinião que as bandas p41 (e portanto p160 e p120), p32, p24 ou p18 representem proteínas específicas do HIV. Até mesmo se pudesse ser mostrado que todas estas proteínas sejam específicas para o HIV, não pode ser presumido automaticamente que os anticorps que reagem com cada uma destas proteínas sejam específicos da infecção HIV. Pádronização dos testes de anticorpos de HIV Um teste de anticorpo se torna significativo somente quando ele é padronizado; isto é, quando o primeiro resultado de um determinado teste tem o mesmo significado em todos os pacientes, em todos os laboratórios e em todos os países. Das primeiras reações de antígeno-anticorpo realizadas pelos grupos de Montagnier e de Gallo foi descoberto que: (a) nem todas as “proteínas HIV” reagem com todos os soros de pacientes da AIDS ou até mesmo com o soro do mesmo paciente obtido em tempos diferentes; (b) o soro de pacientes de AIDS pode reagir com outras proteínas além daquelas consideradas serem antígenos HIV. Por causa das reações variáveis, uma exigência essencial era estabelecer um critério sobre o que constitui um WB positivo. Inicialmente, o grupo de Montagnier considerou a p24 suficiente para definir um WB positivo, enquanto que o grupo de Gallo considerava suficiente a p41. A maioria, se não todos os outros laboratórios, usavam o critério recomendado pelo CDC, que era o de uma banda em p24 ou p41. Por 1987 se tornou óbvio que estas bandas não eram específicas do HIV. Sobretudo, até 1987, “havia tantos procedimentos WB como existiam laboratórios fazendo a avaliação”. Desde então, todos os maiores laboratórios tem mudado o críterio deles para interpretação do WB, mas nos EUA ainda não há um critério de consenso nacional, até mesmo entre os maiores laboratórios: (a) Em 1987 o FDA licenciou um kit de teste WB fabricado pela DuPont. O kit da DuPont permanece o único licenciado e é usado por uma minoria de laboratórios. Ele especifica um críterio “extremamente restrito” para o resultado positivo denominado “bandas específicas representam três diferentes produtos de genes: p24 (gag), p31 (pol), e uma banda env, seja gp41, gp120 ou gp160″; (b) A Cruz Vermelha Americana define um resultado positívo como a presença de anticorpos para ao menoss um produto de gene de cada um dos genes GAG, POL e ENV, sem especificar que bandas; (c) Os Diretores da Associação do Estado e Territorial de Saúde Pública/Departamento de Defesa/CDC consideram um WB positivo se dois de p24, gp41 e gp120/160 são reativos; (d) O Consórcio para Padronização da Sorologia dos Retrovirus (CRSS) define um WB positivo como a presença de anticorpos para ao menos p24 ou p31/32, e gp41 ou gp120/160. Todos os outros maiores laboratórios dos EUA tem seu próprio critério. Para todos os laboratórios um resultado negativo exige a ausência de todas as bandas, inclusive das bandas que não representam “proteínas do HIV” Todos os outros padrões que não satisfaçam o critério de um dado laboratório para um teste psitivo ou negativo são vistos como indeterminados por aquele laboratório. Portanto, na literatura científica, nenhuma tira tem sido publicada de um WB positivo padrão. O manual de instrução de um fabricante de kit WB, Bio-Rad, contém um trecho mostrando “Exemplos de amostras típicas do soro de um paciente reativo e reação com um controle forte, fraco e não reativo” e também afirmou, “Este exemplo mostra apenas típicos padrões reativos e não é para serem usados como referência para comparações com resultados de amostras de soros desconhecidas… As amostras dos pacientes podem mostrar vários graus de reatividade com diferentes proteínas, portanto mostrando diferentes padrões de desenvolvimento de bandas… Cada laboratório realizando o teste Western Blot deve desenvolver seu próprio critério para interpretação da banda. Alternativamente, a interpretação da banda deve ser deixada para o clínico”. Além dos problemas óbvios associados com a falta de padronização, todas as interpretações acima possuem problemas maiores: Quando são usados os critérios do FDA para interpretar um WB, somente um número mínimo [menos de 50%] dos pacientes de AIDS tem um teste WB positivo, isto é, estão infectados pelo HIV. Se são usados os critérios do CRSS, a percentagem de pacientes de AIDS que testa positivo aumenta para 79%. Mais importantemente, até mesmo sob os critérios mais restritivos, 10% das amostras de controle, que incluem “espécimens de doadores de bancos de sangue” tem um teste WB positivo. Como já mencionado, Henderson e seus colegas tem demonstrado que p31/32 não são proteínas HIV. Pinter e seus colegas tem demonstrado que p160 e p120 são oligômeros de gp41. Eles também mostraram que o padrão WB obtido é dependente de muitos fatores, incluindo temperatura e concentração de sódio dodecil sulfito usado para “romper” o “vírus puro”, e concluiram: “A confusão sobre a identificação destas bandas tem resultado em conclusões incorretas nos estudos experimentais. Similarmente, alguns espécimens clínicos podem ter sido identificados erroneamente como soropositivos, sob a assunção que estas bandas refletissem reatividade específica contra dois distintos componentes virais e preenchido o critério para positividade verdadeira ou provável. A correta identificação destas bandas afetarão os padrões a serem estabelecidos para a positividade do Western Blot: isto pode necessitar de reinterpretação dos resultados publicados”. A descoberta que a banda p31/32 representa uma proteína celular, e que p120 e p160 são oligômeros de p41, reduz o critério do CRSS e aquela da Cruz Vermelha Americana a duas bandas, p24 e p41, que segundo o Coronel Donald Burke são “menos do que perfeitamente específicas”. Os achados acima reduzem o critério dos Diretores de Laboratório da Associação de Estado e Território de Saúde Pública/Departamento de Defesa/CDC a p24 ou p41, geralmente aceitas como não específicas. A despeito da evidência acima, até o presente, as bandas p160, p120 e p41 são consideradas representarem distintas glicoproteinas do envelope viral. De fato, as atuais orientações da OMS consideram um soro positivo para anticorpos HIV-1 se “duas bandas de glicoproteínas do envelope [com ou sem] outras bandas virais específicas estejam presentes na tira”. Até esta dada, AIDS na África é definida com base clínica. Recentemente, o CDC recomendou a futura inclusão da evidência sorológica para a infecção HIV na definição africana da AIDS. O teste recomendado é o ELISA, que não pode ser considerado específico. Na Rússia, em 1990, de 20.000 testes rastreados psitivos “somente 12 foram confirmados” usando o WB como um padrão ouro. Em 1991, de aproximadamente 30.000 testes rastreados positivos, somente 66 foram confirmados. Na América Latina e no Caribe as definições de AIDS “achados clínicos da infecção HIV” são confirmados “por testagem de anticorps usando ELISA, imunofluorecência ou método Western blot”. Nenhum critério é dado para a interpretação do WB. Reprodutibilidade Os problemas associados com a reprodutibilidade podem ser melhor ilustrados por dois exemplos. O primeiro representa tiras WB de um espécimen de soro obtido de um paciente com AIDS, testado por 19 laboratórios que participaram na segunda conferência do CRSS sobre a padronização do teste WB. Como pode ser visto, o padrão de banda obtido com uma amosta do mesmo soro, varia de laboratório a laboratório, embora todos os laboratórios relatassem este espécimen como positivo. O Grupo de Estudo da Segurança das Transfusões de Sangue (TSS) nos EUA submeteram aproximadamente 100 amostras de pacientes semanalmente para testagem WB durante três períodos separados de vários meses. Com as 100 amostras dos pacientes, eles submeteram alíquotas de 4 plasmas de controle de qualidade (QC), duas positivas e duas negativas. A positividade ou negatividade para o HIV “era baseada na experiência coletiva com cada plasma usando: (1) sistemas licenciados EIA de cinco fabricantes, (2) um ensaio de imunoflorescência, (3) IB em quatro laboratórios de referência, e (4) um ensaio de radioimunoprecipitação em um laboratório adicional”. (EIA = ELISA; IB = WB). As amostras então foram enviadas para os laboratórios de referência que estavam cientes da testagem do controle de qualidade, mas “os rótulos e códigos não permitiam a identificação dos espécimens QC tais como lincagem a prévios espécimens QC”. QC1#(+) foi submetido 40 vezes ao laboratório A, 5 vezes ao laboratório B e 45 vezes ao laboratório C. * A relatou os seguintes padrões de banda: p24, p32, gp41/120, 7 vezes; p24, gp41/120, 28 vezes; p24 somente, 5 vezes. * B relatou: p24, p32, gp41/120, 4 vezes; p32, gp41/120, uma ocasião. * C relatou: p24, p32, gp41/120, 26 vezes; p24, gp41/120, 10 vezes; p24, p32, duas vezes; p24 sozinho, 5 vezes; “outros”, uma vez; sem bandas, uma vez. QC#2(+) foi enviado em um total de 89 vezes aos três laboratórios e foi relatado: p24, p32, gp41/120, 64 vezes; p24, gp41/120, 19 vezes; p24, p32, uma vez; p32, p41/gp120, 4 vezes,nenhuma banda, uma vez. Um total de 101 aliquotas de duas amostras negativas de controle de qualidade QC#3(-) and QC#4(-) foram enviadas a três laboratórios. Eles relataram: sem bandas, 67 vezes; “outras” bandas, 13 vezes; gp41 somente, uma vez; p24 somente, 18 vezes; p24, p32, gp41/120, duas vezes. Um painel especial das amostras QC foi enviado aos laboratórios B, C e um adicional laboratório D. O painel consistia de três alíquotas de cada uma das oito amostras, inclusive os lotes QC#1(+), QC#2(+), QC#3(-), e QC#4(-). Discutindo os resultados psteriores os autores afirmam : “Somente os relatórios do laboratório C com o painel eram consistentes com os dados reunidos de todas as outras avaliações de reatividade… O Laboratório B relatou as três alíquotas de QC#1(+) como respectivamente positivas com base nas três bandas (gp41, p55 and p65), indeterminado com base em uma única banda (gp41), e negativo (sem bandas observadas). Além disso, todas as três alíquotas de QC#6(-) foram consideradas indeterminadas porque apenas uma única banda foi vista (gp41). O Laboratório D relatou uma alíquota de QC#6(-) como positivo (p15, p24, p32, gp41, p65) e outras duas alíquotas como negativas (sem observação de bandas). Ele também relatou uma banda em p55 para todas as três alíquotas de QC#3(-)”. Ao considerar os resultados detalhados acima deve-se ter em mente que eles ocorreram em laboratórios de referência,isto é, laboratórios de primeira classe, que constituem apenas um pequeno número de laboratórios que realizam a testagem de WB nos EUA. Além disso, muitos laboratórios continuam a utilizar kits não licenciados de WB por causa do custo e “critério restrito exigido para interpretar o teste licenciado”. Especificidade dos testes de anticorpos HIV A tarefa de autenticar um novo teste de diagnóstico na medicina clínica requer um método alternativo independente de estabelecer a presença da condição para a qual o teste deve ser empregado. Este método, frequentemente referido como padrão ouro, é um crucial sine qua non, e representa uma doutrina sobre a qual repousa a prova científica de validade. O único possível padrão ouro para os testes de anticorpo HIV é o próprio vírus da Imunodeficiência Humana. Obviamente, a síndrome clínica e a diminuição das células T4 não pode ser considerado um padrão ouro. Embora o HIV nunca tenha sido usado como um padrão ouro, há um consenso geral que a prova da especificidade dos testes de anticorpo do HIV é firmemente estabelecida. Para o ELISA, as melhores estatísticas de Gallo, obtidas de pacientes de AIDS e 297 doadores de sangue sadios, foram 97.7% de sensibilidade e 92.6% de especificidade assumindo os testes fronteiriços como positivos, e usando uma síndrome clínica como padrão ouro. Coronel Donald Burke e seus colegas do Instituto do Exército Walter Reed nos EUA são creditados como tendo a mais profunda pesquisa do problema, definindo a especificidade do anticorpo HIV em uma grande população e os dados dele são amplamente acreditados serem os melhores. Burke et al testaram a sub poppulação altamente selecionada saudável de 135.187 indivíduos escolhidos de uma prevalência muito baixa de infecção HIV. 1/10 de uma base muito maior de candidatos (1.2 milhões), ao serviço militar dos EUA. Todos os candidatos foram submetidos a um teste inicial ELISA. Todos os testes reativos ao ELISA foram repetidos. Então foi relizado um teste inicial WB e, se diagnóstico ou reativo, foi realizado um segundo teste WB em outra amosta de sangue fresco. Inicialmente o critério para um WB positivo e diagnóstico era “a presença da banda 41kd, uma combinação de bandas 24 e 55kd, ou ambas”. Começando em 1987, o método de preparar as faixas de amostra foram modificadas de forma que os anticorpos para gp120 e gp160 pudessem ser detectados reproduzidamente, e o critério para um padrão reativo e diagnóstico foi mudado por aqueles dos “Diretores de Laboratório da Associação de Estado e Território de Saúde Pública”. Um teste positivo de WB era diagnosticada se e somente se a primeira e a segunda amostra do soro eram diagnósticas de WB. Todos as amostras diagnósticas de WB eram então analisadas com quatro outros testes de anticorpos. Um WB era considerado “verdadeiro positivo” se todas as quatro análises de todas as amostras de sangue disponíveis de um candidato eram reativas e diagnosticas, mas consideradas falsos positivos se todas as quatro análises das amostras disponíveis do soro eram não reativas, não diagnósticas ou ambas”. De 135.187 candidatos, somente 16 testaram positivo. Em um deles o soro não estava mais disponível para testagem posterior e um candidato se recusou a fornecer uma segunda amostra. O soro de 27 das 29 amostas de 15 candidatos encontrados positivos foram testados para outros quatro testes de 4 anticorpos. 14 amostras foram encontradas positivas para todas as quatro análises e todas as quatro foram negativas para um candidato. De tudo isto, Burke e seus associados calcularam uma taxa de falso positivos de 1 em 135.187, ou 0.0007%. Eles também especularam sobre as implicações que este dado pode ter na inteira população de 1.2 milhões de candidatos. Eles calcularam a completa prevalência de 1,48 por 1000 na inteira pesquisa como equivalente a 200 por 135.187. Assumindo que a taxa de falsos positivos é a mesma da população inteira, eles estimaram que desde então existirá 200 testes verdadeiramente positivos em cada 135.187 pessoas na qual somente uma será um falso positivo; então “o valor previsível de um diagnóstico positivo no programa é 99.5%, e a especificidade é de 99.9%”. Grande parte do raciocínio de Burke e seus colegas está aberta a crítica: 1. Não existe um padrão ouro para definir a infecção por HIV. O fato de testar positivo para o WB em 15 candidatos remanescentes contra quatro outros testes de anticorpos não habilita uma instituição independente de declarar a “verdadeira” infecção pelo HIV como eles são os mesmos testes; 2. Eles definem: (a) os testes verdadeiramente positivos como amostras que repetidamente testam positivas em quatro testes similares. (b) os testes falso positivos são as amostras que repetidamente testam negativas em quatro testes similares. O número de amostras testadas e de repetições é arbitrariamente definido. Seria impossível prever qual seria a consequência se por exemplo os testes de ELISA fossem repetidos três ao invés de duas vezes ou se as amostras que testaram negativo no primeiro teste ELISA fossem testadas novamente com um outro teste ELISA ou WB. Há relatórios bem documentados nos quais o teste ELISA é negativo e o WB é positivo. (c) a taxa de falso positivos como o número de resultados falso positivos dividido pelo número de amostras testadas. Estas definições não sustentam qualquer semelhança com aquelas descritas nos textos padrão. As definições corretas são: (i) Um verdadeiro positivo é um teste positivo que ocorre em um indivíduo que está infectado como definido por um padrão ouro independente; (ii) um falso positivo é um teste positivo que ocorre em um indivíduuo que, pela aplicação do padrão ouro, não tem infecção HIV (mas não está necessariamente sadio); (iii) A taxa de falso positivo é o número de testes falso positivos como uma fração do número total de indivíduos que, pela aplicação do padrão ouro, não estão infectados pelo HIV. 3. As premissas de Burke et al são bem opostas aquelas de Gallo et al onde todos os resultados positivos do teste em indivíduos sadios são vistos como falso positivos. Baseado nas premissas de Gallo e seus associados, devemos ver todos os 16 casos como falso positivos já que não há razão compelente para ver os candidatos ao serviço militar diferentemente dos doadores sadios de sangue. 4. A extrapolação de Burke para todos os 1.2 milhões de candidatos é inválida. Esta extrapolação só pode ser feita se os 135.187 candidatos fossem selecionados aleatoriamente do grupo inteiro, o que não foi. No resto da população a taxa de falso positivo deve ter sido muito mais alta, por exemplo como um resultado de concentrações mais altas de globulinas em geral ou de anticorpos em particular. A estatística deles estabelecida tendo um valor previsível de 99.5% dos positivos é impossível de ser alcançada sem o conhecimento da sensibilidade do teste WB e a prevalência da verdadeira infecção pelo HIV, até mesmo se a extrapolação e a especificidade estivessem corretas. 5. É imopssível definir a especificidade, sensibilidade e valor de previsão com o algorítmo usado por Burke e seus associados. O melhor que eles podem fazer com o algoritmo deles é determinar a reprodutibilidade dos testes ELISA e WB. A este respeito, no estudo mais amplo de Burke dos 1.2 milhões de candidatos militares saudáveis, aproximadamente 1% de todo número inicial e 50% de todos ELISA repetidos foram positivos; e 30-40% dos primeiros WB foram positivos e 96% do segundo WB foram positivos. Em outras palavras, o estudo mais amplo de Burke revela: (a) 6.000 indivíduos com ELISA inicialmente positivo e subsequentemente negativo. (b) 4.000 indivíduos com dois testes positivos para o ELISA seguido de um teste negativo para WB. (c) 80 indivíduos com dois testes positivos ELISA, um WB inicialmente positivo e uma repetição negativa de WB. Isto não pode ser visto com um problema trivial já que: (i) tanto ELISA quanto WB são vistos como altamente sensíveis e específicos. (ii) Vários milhares de indivíduos sadios tem anticorpos que reagem com as proteínas “HIV” mas que não estão condenados a estarem infectados pelo HIV; (iii) Até mesmo nos melhores laboratórios, 80 dos candidatos saudáveis de Burke seriam diagnosticados com infectados pelo HIV já que, diferentemente de Burke, somente um WB é realizado. O problema se torna até mesmo mais sério quando entendemos que por setembro de 1987, baseado nos testes de anticorpos, um relacionamento casual entre HIV e AIDS era geralmente aceito, um único ELISA positivo ou um WB positivo, uma banda [seja p24 ou p41) era suficiente para confirmar a infecção HIV. Atualmente, a opinião geral é que os testes ELISA tem uma "sensibilidade e especificidade acima de 98% e muitos se aproximam a 100%], e a definição da AIDS dada pelo CDC “aceita um teste reativo para HIV, em combinação com um indicador da doença, é altamente indicativo de verdadeira doença pelo HIV”. Burke et al, como Gallo et al, determinaram a especificidade sem referência a indivíduos doentes. A definição de especificidade exige que o teste seja avaliado em pessoas que não apresentam doença que está sob exame, incluindo indivíduos doentes que tem outras doenças onde os anticorpos, alguns deles, podem interagir com os antígenos HIV, que podem estar sendo produzidos por outras razões. A especificidade dos testes de anticorpos para HIV deve ser determinada ao testar indivíduos que estão imunossuprimidos e/ou que tem sintomas ou sinais clínicos similares aos da AIDS, mas que não são considerados terem AIDS ou infecção por HIV. Este ponto é bem ilustrado pelos testes sorológicos para sífilis. Uma pessoa sadia que não esteja infectada pelo Treponema pallidum muito raramente testaria positivo [falso positivo]. Contudo vários autores atestam a presença em várias desordens não relacionadas de testes biológicos falso positivos para a sífilis (BFPS), o que pode ocorrer em pacientes com anemia hemolítica auto imune, hanseníase, lupus eritematoso sistêmico (SLE), purpura trombocitopenica idiopática e viciados em drogas. Mais de 20% dos viciados em drogas testam positivo e tem alta incidência de BFPS. Pessoas com BFPS também são descobertas “terem uma alta frequência de outras anormalidades sorológicas incluindo fatores anti nucleares, auto anticorpos e alterações da gama globulina”. Isto levou os pesquisadores a concluirem que “uma reação BFP frequentemente é um marcador de uma desordem não identificada do sistema imunológico que predispõe a doenças auto imunes”. Isto tem significância ao fato de que uma alta proporção (14%) dos pacientes de AIDS também foram descobertos terem uma sorologia falso positiva para sífilis. Ao menos dois grupos de pesquisadores levantaram a possibilidade de que o teste de anticorpos para o HIV nos africanos e usuários de drogas intravenosas podem também ser uma reação BFP. Jaffe et al testaram 1.129 amostras de soro de usuários de drogas intravanosas e 89 não usuários para controle. Todas as amostras foram coletadas durante 1971-1972 e testadas por dois comerciais ELISAs e WB. 17 amostras dos usuários de drogas intravenosas, mas nenhuma dos controles foram achadas positivas. Eles concluiram: Com base nos nossos dados positivos para o Western Blot, parece que os usuários de drogas parenterais podem ter sido expostos ao HTLV-III ou a um vírus relacionado já em 1971. Uma explicação alternativa igualmente viável é que a soropositividade ao HTLV-III detectada nestas amostras representem falsos positivos ou reações não específicas. Biggar e seus colegas descobriram que em africanos sadios, a probabilidade de encontrar um teste de anticorpo positivo para HIV aumenta significativamente com o aumento dos níveis de complexos imunes. Eles concluiram “a análise da reatividade ao ELISA e ao Western pode não ser específica nos africanos… a causa da não especificidade precisa ser esclarecida para determinar como elas podem afetar a soroepidemiologia dos retrovirus em outras áreas que não a África, tal como o Caribe e o Japão”. Que um teste WB positivo em todos indivíduos pode representar uma reação BFP é sugerido pela evidência da retrovirologia em geral e da testagem de anticorpos para HIV em particular. É conhecido que todos os anticorpos, incluindo o MCA, são poliespecíficos e são capazes de reagir com antígenos imunizantes bem como com outros auto componentes ou não componentes. Em relação aos retrovirus, a literatura científica está cheia de dados que convincentemente mostram a presença disseminada da interação não específica entre os antígenos retrovirais e anticorpos não relacionados. Grande parte deste trabalho tem aparecido como resultado da pesquisa da origem viral de neoplasmas humanos e animais. Em 1975 Gallo discobriu que pacientes com leucemia tem infecção disseminada [anticorpos] para um retrovirus que Gallo afirmou ter isolado de culturas e tecidos frescos destes pacientes e que ele deu o nome de cHL23V. Gallo sugeriu que este virus estava etiologicamente associado com a doença mas o HL23V mais tarde mostrou ser “um coquetel” de dois vírus de macaco. Em 1980 Gallo descobriu o HTLV-I que ele e seus associados afirmam ser a causa da leucemia adulta de células T. Acima de 25% dos pacientes de AIDS tem anticorpos para este vírus, contudo os pacientes de AIDS não desenvolvem leucemia adulta de células T mais frequentemente do que a população em geral. Isto somente pode ser interpretado como: ou o HTLV-I não causa a leucemia adulta de células T ou alguns anticorpos retrovirais detectados nos pacientes de AIDS não são específicos. Em 1986 Essex obteve evidência sorológica para, e isolada, um outro retrovirus humano, HTLV-IV. O HTLV-IV de Essex foi mais tarde demonstrado ser um virus do macaco, agora chamado de Virus da Imunodeficiência Simiana. Que um WB positivo pode não representar uma prova da infecção pelo HIV mas somente um marcador inespecífico para a AIDS, é sugerido pelos seguintes dados: – em viciados em drogas há uma forte associação entre altos níveis de soro globulinas e um teste de anticorpo positivo HIV e esta foi a “unica variável que permaneceu significativa no modelo logístico de regressão; – em crianças, usando o WB como padrão ouro, a hipergamaglobulinemia identificada em crianças infectadas pelo HIV com uma especificidade de 97%. – 63 soros obtidos de 23 pacientes antes e imediatamente depois de uma infusão de imunoglobulina foram testadas para anticorpos HIV usando o WB. Dos 63 soros, 52 (83%) foram encontrados positivos. “Várias amostras testadas em um radiioimuneensaio p24 HTLV-III também foram positivos. A quantidade de anticorpo detectada foi a maior imediatamente depois da infusão e diminuiu entre as infusões “. Um indivíduo recebeu seis injeções de 5 ml de soro doado Rh +, administrados em intervalos de 4 dias. “O doador do soro foi demonstrado ser negativo para o anticorpo HIV e o antígeno ELISA, assim o sangue foi retirado de sua mulher e filho”. “O sangue retirado depois da primeira imnização foi mostrado ser negativo para o anticoro HIV no ELISA e no WB. Depois da segunda imunização um fraco sinal no ELISA, ligeiramente acima do nível de isolamento, foi monitorado. Depois da terceira imunização o sinal estava forte e o WB revelou uma interação distinta com as proteínas p17 e p55. Um sinal até mesmo mais forte foi monitorado depois da 5a. imunização. Interaçao com p17, p31, gp41, p55 e algumas outras proteínas foi evidente”. Já que: (a) indivíduos dos principais grupos de risco da AIDS, isto é, homens gay, usuários de drogas, e hemofílicos são exopostos a muitas substâncias estranhas tais como sêmen, drogas, fator VIII, sangue e componentes do sangue; (b) indivíduos que pertencem aos grupos acima geralmente desenvolvem infecções não relacionadas ao HIV; poderíamos esperar que estes indivíduos tenham altos níveis de anticorpos dirigidos contra antígenos outros que o do HIV. De fato, no presente, existe a evidência que indivíduos com AIDS, complexo relacionado a AIDS (ARC) e aqueles em risco, tem em circulação complexos imunes, anticorpos contra fator reumatóide, anti cardiolipina, anti DNA, fator anti nuclear, anti celular, anti plaquetário, anti células vermelhas, anti actina, anti tubulina, anti tiro globulina, anti albumina, anti miosina, anti trinitrofenil e anti timosina. Os auto anticorpos e anti linfócitos tem sido encontrados em 87% dos pacientes HIV+, e seus níveis se correlacionam com o estado clínico. Diferente do soro normal, 37% dos soros de HIV+ foram descobertos serem positivos para retrovirus tipo D, embora o HIV seja pensado ser um Lentivirus. É também conhecido que (a) os níveis de IgG no soro são mais altos nos doadores negros do que em caucasianos; alguns grupos de risco, usuários de drogas e homens gay são expostos a alto níveis de agentes mitogênicos, sêmen e nitritos, e que animais tratados com tais agentes desenvolvem anticorpos que reagem com antígeno retrovirais. Que o teste de anticorpo positivo para HIV pode ser o resultado de estimulação antigênica, outra que o HIV, é posteriormente sustentado pelos seguintes dados: 1. HIV é pensado ser transmitido por agulhas infectadas, ainda que a percentagem mais alta de prostitutas usem drogas orais (84%), do que endovenosas (46%), e testem positivo; 2. “Descendências autoimunes de camundongos MRL-lpr/lpr e MRL-+/+ fazem anticorpos contra gp120″. Os camundongos tem sido expostos a linfócitos T de outra descendência murina e foram mostrados fazerem anticorpos contra gp120 e p24 do HIV. 3.Receptores de sangue negativo soroconvertem e desenvolvem AIDS enquanto os doadores continuam saudáveis e soronegativos. 4.Em indivíduos sadios, parceiros de indivíduos HIV+, receptores de transplante de órgão e pacientes com SLE, um WB positivo pode reverter negativo quando exposto ao sêmen, terapia imunosupresiva ou ocorrência de melhora clínica; 5.Conquanto a frequência de testes positivos de anticorpos HIV em sadios doadores e candidatos militares seja baixa, pacientes com tuberculose (TB), inclusive aqueles com TB localizada nos pulmões, tanto nos EUA quanto na África tem alta frequência , acima de 50% de WB positivos. Nos EUA (26 hospitais estudados), pacientes que não estão em risco de desenvolverem AIDS, e que não tem doenças infecciosas, tem uma alta taxa de WB positivos , (1.3% a 7.8%). Os dados acima podem ser interpretados ou como uma prova de que o HIV está se disseminando na popuulação heterossexual ou que os testes de anticorpos para o HIV não são específicos. Este último é o caso que é sugerido pelo fato de que em 1988, nos EUA, somente aproximadamente 66 homens brancos foram relatados terem adquirido AIDS heterossexualmente. Em 1992, em New York, somente 11 homens foram relatados terem adquirido AIDS por infecção heterossexual. Rodriguez e seus colegas descobriram que índios amazônicos que não tem contacto com indivíduos externos de suas tribos e não tem AIDS, têm uma taxa de soropositividade WB de 3.3-13.3% , dependendo da tribo estudada. Em um outro estudo, eles descobriram que 25%-41% dos pacientes venezuelanos de malária tem um testes WB positivo, mas não tem AIDS. Os dados acima significam ou que o HIV não está causando a AIDS “até mesmo na presença de severos distúrbios imuno reguladores característicos da malária aguda”, como concluiram Rodriguez et al, ou que os testes de anticorpos para o HIV não são esspecíficos. Os problemas associados com a especificidade do teste WB podem ser evitados pelo uso de apenas um padrão ouro apropriado, o isolamento do HIV. Até esta data isto não tem sido feito e baseado nos problemas associados ao isolamento do HIV, pode ser que nunca isto seja possível. Isolamento do HIV Continuamos sem dizer que o isolamento do vírus pode ser usado como padrão ouro apenas se ele fornece evidência genética, molecular e virológica conclusiva para a existência de um único vírus. Para os retrovirus, como primeiro passso na direção desta meta devemos:

• (a) encontrar partículas com características morfológicas similares a outros retrovirus;

• (b) demonstrar que estas partículas tem um conjunto único de componentes estruturais, incluindo RNA e proteínas que pertencem somente a estas partículas e a nenhuma outra entidade.

A Peyton Rous é creditado a primeira descoberta e isolamento de um retrovírus. Em 1911 ele foi capaz de repetidamente induzir tumores em um cruzamento particular de galinhas por meio de filtrados livres derivados de células de tumor. Rous contemplou que ou “um organismo parasita” ou um “estimulante químico’ pode formar as bases de suas observações; não obstante, os filtrados indutores de tumor se tornaram conhecidos como “virus filtráveis” ou “oncovírus”. Na década de 1950, em culturas animais e em tecidos frescos, especialmwente tecidos de tumor, partículas mais tarde atribuídas a retrovirus eram prontamente detectáveis com o microscópio eletrônico (EM). Em 1970, a enzima transcriptase reversa (RT) que tanscreve o RNA em DNA, foi descoberta nos oncovirus. Por causa disto, na década de 1970, os oncovirus se tornaram conhecidos como retrovirus. Na década anterior, a centrifugação por gradiente de densidade foi introduzida para separar e isolar partículas sub celulares, incluindo virus. Porque alguns constituintes celulares foram descobertos terem a mesma densidade de flutuação dos virus, quando os virus eram isolados de culturas celulares, os melhores resultados podiam ser obtidos com os fluidos sobrenadantes que: (a) tinham alta concentração viral; (b) tinham baixos contaminantes celulares. Isto foi melhor satisfeito por vírus não citopáticos e por condições de cultura que mantivessem o máximo de viabilidade celular. A maioria dos retrovirus animais [exceções feitas aos chamados virus de imunodeficiências] satisfazem as condições acima. Tirar vantagem das propriedades retrovirais acima, pela repetida suspensão e sedimentação em gradientes de densidade de sucrose, podemos obter, na densidade de 1.16 gm/ml, uma concentração relativamente pura de partículas retrovirais, isto é, obter partículas retrovirais, separadas de tudo o mais, e assim isola-las. Não obstante, como tantos retrovirologistas ressaltam, a contaminação da preparação viral com partículas tipo vírus que contém a enzima transcriptase reversa, microssomas de células rompidas, “vesículas membranosas que podem englobar outros constituintes nucleares, incluindo ácidos nucleicos”, especialmente quando uma “inadvertida lise de células” foi induzida, não pode ser evitada. Por causa disto, para provar que o material que bandeou em 1.16 gm/ml não contenha nada mais além de partículas “sem diferenças aparentes nos aparecimentos físicos”, e que as partículas são de fato retrovirus, toda preparação de retrovirus foi posteriormente analisada usando os seguintes experimentos:

• (1) Eletromicroscopia física para contagem, morfologia e pureza do vírus;

• (2) Atividade bioquímica da trancriptase reversa, RNA viral e celular, proteína total, análise gel das proteinas virais e do hospedeiro e os ácidos nucleicos;

• (3) Infectividade biológica in vivo e in vitro.

Diferente das culturas de vírus animais onde a concentração de partículas é muito alta, nas culturas e co culturas da AIDS a concentração de partículas é baixa, tão baixa que os grupos de Gallo e Montagnier tiveram dificuldade em detecta-las. Diferente da maioria dos retrovirus animais, o HIV é considerado ser um vírus citopático. Se ele é assim, então os sobrenadantes das culturas celulares conterão muitos constituintes celulares. Se, como tem sido recentemente proposto, “um mecanismo único’, a apoptose induzida pelo HIV, pode responder pela morte das células T4, então o sobrenadante deve também conter corpos apoptóticos, isto é, membrana ligada a fragmentos celulares os quais, [como muitos retrovirus], germinam da superfície celular. Já que o tamanho e a composição [alguns contém cromatina picnótica] dos corpos apoptóticos variam amplamente, poderiamos esperar que alguns destes fragmentos também façam banda em 1.16 gm/ml. Isto é significativo para que as culturas e co culturas da AIDS não tenham a máxima viabilidade, e a maioria se não todas as afirmações do “isolamento do HIV” tenham sido de lisados celulares. Sobretudo e mais importantemente, em uma extensa pesquisa da literatura da AIDS, nenhum micrógrafo eletrônico foi encontrado de material que bandeie em 1.16 gm/ml; todos os micrógrafos eletrônicos são de partículas achadas em culturas celulares. Assim é impossível saber se o material “lipídios, proteínas e ácidos nucleicos” que bandeiam em 1.16 gm/ml, (as “puras partículas do HIV”), contenham qualquer uma destas partículas, e se tais partículas estão presentes, qual é sua pureza. A evidência presentemente disponível indica que apenas por volta de 20% das proteínas que bandeiam em 1.16 gm/ml são “proteinas do HIV”, e o restante tem origem celular, includindo as proteínas beta-2 microglobulina e HLA-DR (4.4%). (Assim, até mesmo se as partículas estão presentes em 1.16 gm/ml e todas as proteínas assumidas serem do HIV estão contidas na partícula do HIV, o material que bandeia a 1.16 gm/ml não pode ser considerado “puro HIV”). Reciprocamente, “Grande parte da proteína viral secretada pelas células infectadas pelo HIV não são particuladas, e a proporção [por exemplo] de p24 em virions é uma função do genótipo viral e da idade da cultura. Em casos extremos, menos de 1% do total de p24 e gp120 presentes [na cultura] está em virions”. De fato, o p24 é libertado de “células infectadas independentemente das partículas infecciosas do vírus” e da enzima transcriptase reversa. Deve ser ressaltado que em termos da literatura da AIDS, “HIV”, “isolamento do HIV”, ´”partículas puras”, “partículas de virus”, “virions’ e “partículas infeciosas” tem uma variedade de significados e inclui todos os seguintes, mas mais frequentemente sem prova da presença de uma partícula : (a) “RNA envolvido em proteína”; (b) material dos sobrenadantes de culturas de células quer passam através de estreitos filtros celulares mas que organismos como os micoplasmas também podem passar; (c) o aglomerado obtido pela ultracentrifugação simples do sobrenadante da cultura; (d) recentemente, muito frequentemente, a detecção nas culturas de AIDS de p24. No primeiro relato de “isolamento do HIV’, o grupo de Montagnier detectou em uma cultura mitogenicamente estimulada derivada de biópsias de linfonodos de homens gay com linfadenopatia, “uma passageira”, “atividade de transcrptase reversa”. Nos linfócitos de cordão umbilical mitogenicamente estimulados cultivados com o sobrenadante das culturas acima, eles relataram partículas retrovirais de tipo C [RVP] nas culturas e transcriptase reversa e antígenos que reagem com o soro pré AIDS no material que bandeia em 1.16 gm/ml. O grupo de Gallo não considerou a detecção do acima como representando “um verdadeiro isolamento”, “… o virus não tem sido transmitido para uma linhagem celular permanentemente crescente para o verdadeiro isolamento e portanto tem sido difícil obte-lo em quantidade”. Contudo, embora o grupo de Gallo usasse uma linhagem celular permanente para o “isolamento do HIV”, eles relataram nada mais do que o mesmo fenômeno do grupo de Montagnier. Não obstante, até o presente, a detecção do fenômeno acima é considerado representar o “verdadeiro isolamento” e seus achados em culturas similares é visto como prova da infecciosidade. Todavia, o isolamento é definido como a separação do virus de tudo mais e não como a detecção de algum fenômeno atribuído ao vírus (RT, reações antígeno/anticorpo [WB]); ou similares a estas, (partículas). O fenômeno pode somente ser usado para detecção viral, até mesmo então, se e somente se, o fenômeno tem sido identificado como sendo específico do vírus, ao usar o virus isolado como um padrão ouro. Embora isto não tenha sido feito, a evidência indireta presentemente disponível [isto é, a evidência que tem sido obtida sem um padrão ouro] da retrovirologia geral e da pesquisa da AIDS, indica que RT, RVP e reações antígeno/anticorpo não são específicas do HIV [ou até mesmo de retrovirus]. A especificidade das reações antígeno/anticorpo já tem sido discutidas e não serão posteriormente mencionadas. Em qualquer caso, esta reação não pode ser usada como um padrão ouro para o WB, já que um teste não pode ser o seu próprio padrão ouro. Transciptase Reversa Em toda pesquisa HIV, a reprodução do primeiro modelo An.dT15 quando incubado com o sobrenadante ou o material que bandeia em 1.16 gm/ml de culturas ou co culturas de AIDS é considerado prova da atividade de transcriptase reversa do HIV. Em muitos casos, esta atividade é considerada sinônimo de “isolamento do HIV” e é usada para quantificar o vírus. Todavia: 1. O mesmo primeiro modelo é também reproduzido quando incubado com material que bandeia a 1.16 gm/ml das culturas leucêmicas de células T e de espermatozóide normal e não infectado. Ambos, An.dT15 e Cn.dG15 são copiados de material que faz banda em 1.16 gm/ml originados de linfócitos não infectados mas estimulados mitogenicamente. 2. An.dT15 é copiado não apenas pela RT mas também por duas [beta e gama] das três polimerases celulares do DNA. De fato, em 1975, uma Conferência Internacional sobre Polimerases no DNA Eucariótico definiu a polimerase gama do DNA como enzima celular que ” copia An.dT15 com alta eficiência mas não copia o DNA bem”. Assim, reproduzir o primeiro modelo An.dT15, não pode ser considerado sinônimo da presença da RT do HIV. Detecção de Partícula Os retrovirus são partículas infecciosas envolvidas com um diâmetro de aproximadamente 100-120 nM com um núcleo compreendendo uma concha de proteína e um complexo ribonucleico. Os retrovirus são classificados em três sub famílias: “Spumavirinae, Lentivirinae e Oncovirinae”. Os retrovirus pertencentes a sub família oncovirinae são divididos em partículas Tipo A, B, C e D. Não obstante, alguns dos retrovirologistas mais conhecidos não consideram o achado “de partículas tipo vírus morfológica e bioquímicamente semelhante”, retrovirus, prova da existência de tais retrovirus. Na década de 1970, tais partículas eram frequentemente observadas em tecidos da leucemia humana, culturas de tecidos embrionários e “na maioria se não todas, placentas humanas”. Contudo, elas continuam a ser “um problema importante e intrigante que permanece não resolvido”. As partículas detectadas nas culturas e co-culturas da AIDS são consideradas por todos os pesquisadores da AIDS como sendo do HIV. Contudo: 1. Não há acordo de a que gênero ou até mesmo subfamília de retovirus elas pertencem. Algumas vezes o acordo não é encontrado até mesmo dentro do mesmo grupo. Por exemplo, o grupo de Montagnier inicialmente ‘relatou o HIV como um oncovirus Tipo C, então como um oncovirus Tipo D e subsequentemente como pertencente a uma subfamília diferente de retrovirus – a “Lentivirinae”. Sobretudo, as “partículas do HIV” nos monócitos diferem dos Oncovirus Tipo C e dos Lentivirus. 2.A despeito do supramencionado, Gelderblom et al levaram adiante um modelo de HIV o qual tem uma morfologia e uma composição bem definida, incluindo protuberâncias de superfície compostas de p120, uma proteina considerada ter um papel crucial na citopatogenicidade e ser indispensável para a infectibilidade do HIV. O modelo tem sido aceito e é bem conhecido. Contudo, o mesmo grupo usando microscopia eletrônica e microscopia eletrônica imunológica tem mostrado que: (a) As protuberâncias são apenas encontradas em partículas imaturas. As partículas imaturas “são raramente observadas” e são vistas apenas em “células metabolicamente danificadas”; (b) As partículas maduras são “difíceis, se de tudo, de serem rotuladas” pelos soros de AIDS e de ARC. As partículas imaturas são “altamente rotuladas”, mas asssim é o resto da célula da qual elas estão se projetando, o que “pode ser devido ao fato de que o soro natural imunológico é de fato inespecífico”; (c) como o soro, os anticorpos contra a p120 reagem preferencialmente com as partículas imaturas. MCA contra proteínas GAG rotulam suas partículas maduras, mas elas também rotulam partículas de HIV-2 e partículas do virus da imunodeficiência simiana; (d) nas partículas HIV, incluindo sua membrana, eles bem como outros, detectaram muitas proteínas celulares, mas com a possível exceção de “corpos laterais”, estas proteínas não são incluídas no modelo idealizado do HIV. 3. A culturas infectadas de células T e de monócitos “infectados pelo HIV” contém, em adição as partículas com as morfologias atribuídas ao HIV, muitas “outras partículas virais” diferentes de qualquer uma das “particulas do HIV”. As células H9 não infectadas pelo HIV, das quais tem se originado a maioria das microscopias eletrônicas publicadas bem como as outras células usadas para o “isolamento do HIV”, CEM, C8166, EBV células B transformadas, e linfócitos sanguíneos de cordão umbilical, expressam brotamento de partículas “tipo virus” embora sejam de certas formas diferentes das partículas aceitas como HIV. Os dados acima levantam perguntas não somente a respeito da origem e papel destas “partículas não HIV” mas também sobre as “partículas HIV”, e como as quais, se algumas destas partículas, fazem banda em 1.16 gm/ml. 4. Partículas protuberantes e as maduras partículas Tipo C aparecem em células metabolicamente danificadas e nas células de linfoma não infectados por HIV de linfomas. “As partículas retrovirais” antigenicamente relacionadas ao HIV tem sido encontradas em culturas de extratos de glândulas salivares de pacientes com a Síndrome de Sjorgen. O achado independente de partículas “tipo virus” nos linfonodos de pacientes de Aids com linfadenopatia e de proteínas nos linfonodos que reagem com o MCA para p55, p24 e p18 foram interpretados como prova de que “as partículas tipo virus” eram do HIV. Contudo: (a) MCA para p18 reage com tecidos linfáticos de pacientes que sofrem de inúmeras doenças não relacionadas a AIDS e também em indivíduos sadios; (b) Como nas culturas e co culturas da AIDS, nos linfonodos de pacientes com AIDS e linfadenopatia persistente generalizada, além das “partículas HIV”, partículas diferentes daquelas do HIV são também encontradas; (c) Mais importantemente, apenas no estudo da microscopia eletrônica, seja in vivo ou in vitro, na qual os apropriados controles foram usados e com extensos exames de controles cegos e a realização da testagem do material, as partículas de virus indistinguíveis do HIV foram encontradas em uma variedade de linfadenopatias reativas não associadas ao HIV levando os autores a concluirem: “a presença de tais partículas por elas próprias não indicam infecção por HIV”. Comentários sobre “Isolamento” Podemos concluir que nem a reação antígeno/anticorpo, nem as partículas, nem a RT, podem ser consideradas específicas dos retrovirus. Até mesmo se elas fossem, seus achados não podem ser considerados sinônimos da detecção de um retrovirus adquirido externamente, como é afirmado no caso do HIV. Tais achados podem representar a expressão de um retrovirus endógeno [veja abaixo] ou de um outro retrovirus exógeno. Ultimamente, “vários laboratórios relataram atividade retroviral [RT, partículas] em células de pacientes que parecem não estar infectados pelo HIV, uma atividade dita ser “de retrovírus endógeno”. A linhagem celular mais frequentemente usada na pesquisa da AIDS é a linhagem H9 de células leucêmicas. É sabido que H9 é um clone de HUT78, que foi derivado de um paciente com leucemia adulta de células T. Já que o agente causador desta leucemia é aceito ser o HTLV-I, um outro retrovirus exógeno, as culturas de H9 devem ter RT e partículas retrovirais até mesmo na ausência de HIV. Porque aproximadamente 25% dos pacientes de AIDS tem anticorpos para HTLV-I, aproximadamente 25% das culturas devem ter em adição às partículas e a RT, um WB positivo para HTLV-I. Contudo, já que as proteínas do HIV e do HTLV-I partilham os mesmos pesos moleculares, as bandas de HTLV-I no WB aparecerão serem positivas para HIV. Um problema mais direto associado com o uso do “isolamento do HIV” como um padrão ouro é o fato que, a despeito dos vários fenômenos aceitos pelos pesquisadores da AIDS como representando o “isolamento do HIV”, e a despeito do esforço que tem sido deipendido, não é possível “isolar o HIV” de todos os pacientes que testam positivo para os anticorpos. A taxa de sucesso varia entre entre 17% e 80%. Reciprocamente, quando o mesmo esforço é feito, o HIV pode ser isolado do soro de pacientes soronegativos para HIV, e até mesmo de indivíduos normais soronegativos sem risco de infecção por HIV. Com um método mais recente usado para o “isolamento do HIV”, a detecção de p24 nas culturas com o sangue completo não fracionado, os resultados positivos tem sido relatados em 49/60 (82%) de indivíduos “presumidamente não infectados, mas sorologicamente indeterminados” e em 5/5 “doadores de sangue soronegativos”. Já em 1988, os pesquisadores do CDC nos EUA entenderam qu não existe correlação entre “isolamento de HIV” e um teste de anticorpos positivo (o que eles chamam de infecção documentada), e mais importantemente, entre o “isolamento do HIV” in vitro e sua presença in vivo: “a correlação entre estes dois métodos é limitada; eles são inconsistentes, na medida em que o virus não pode ser detectado em cada pessoa com uma infecção documentada. Sobretudo, as técnicas da cultura determinam a habilidade das células infectadas produzirem virus in vitro mas não necessariamente indicam o status da expressão do virus in vivo”. Investigações Genômicas Nas décadas que se seguiram aos experimentos de Rous, Rous bem como outros pesquisadores realizaram investigações similares com várias espécies animais. Contudo, embora a neoplasia pudesse ser induzida pela injecção de filtrados de tecido dos tumores [retrovirus infeccioso, retrovirus exógeno], nenhuma evidência epidemiológica existiu para sugerir uma origem infecciosa do câncer. Em 1939 Andrews “especulou sobre a possível ativação de latentes partículas de infecções virais nos tecidos cancerosos”, e em 1948 Darlington postulou “que tais vírus [virus endógenos] podiam crescer de elementos celulares genéticos que ele chamou de provirus”. Nas décadas de 1950 e 1960 a seguinte evidência experimental foi considerada prova da hipótese proviral: (a) animais sadios nos quais nenhum virus completo pode ser detectado tinham antigenos similares aqueles dos virus exógenos; (b) genomas de DNA ou genomas parciais de retrovirus infeciosos foram encontrados estarem integrados nos genomas de células não produtoras de virus; (c) “A prova final veio com o isolamento de virus infeccioso de células não infectada”. Células sadias não produtoras de virus, quando cultivadas, eram descobertas que espontaneamente produziam virus. Seu aparecimento e manutenção pode ser aumentada um milhão de vezes por (i) estimulação mitogenica; (ii) técnicas de co cultivo; (iii) o cultivo de células com sobrenadantes de culturas não produtoras de virus. (Nota: Para isolamento do HIV, a estimulação mitogenica é uma exigência absoluta e de fato, na maioria dos casos, todos os acima são empregados). Atualmente, é geralmente aceito que “uma das características mais impresionantes que distingue os retrovirus de todos os outros virus animais é a presença, nos cromossomas de células normais não infectadas, de genomas estreitamente relacionados a, ou idênticos, aqueles dos virus infecciosos”. Dependendo das condições, o genoma provirus permanece não expressado ou parte ou todo dele pode ser expressado. O último pode ou não levar a reunião de partículas virais [retrovirus endógeno]. Em outras palavras, o achado de um genoma viral (DNA) ou até mesmo de RNA, antigenos e anticorpos para eles, não é prova da presença de partículas infecciosas. Embora a maioria dos achados supramencionados são de experimentos animais, no presente, existe evidência que “o genoma humano carrega sequências de DNA relacionadas a genomas retrovirais endógenos que são subdivididos em famílias segundo a sequência da homologia. Alguns estão presentes somente em umas poucas cópias, enquanto outros estão presentes em centenas de milhares de cópias”. Os dados animais também mostram que novos retrovirus podem crescer por:

• (a) mistura fenotípica;

• (b) recombinação genética e deleção

Quando uma célula contém dois provirus, a progênie pode ser encontrada possuir o genoma de um mas as proteínas estruturais de um ou outro virus presentes. Reciprocamente, o RNA pode ser viral mas ao menos algumas proteínas podem ser celulares. Em outros casos, as partículas não tem um genoma de todo, um ou mais genes estão faltamdo [virus geneticamente defeituosos]. A mistura genética pode ser entre genomas virais ou entre genes virais e celulares. Segundo importantes virologistas tais como Weiss e Temin, novos genomas retrovirais podem crescer pela reordenação do DNA celular causado por muitos fatores, incluindo processos patogênicos, uma opinião que propõe os retrovirus como um efeito e não como a causa da doença. O tempo e o aparecimento do genoma viral “pode ser de milhões de anos nas células da linhagem do germe e dias nas células somáticas”. Além do supramencionado, o ciclo replicador retroviral “envolve três passos distintos: transcriptase reversa, polimerização do DNA e a síntese do RNA do modelo do DNA [transcrição] . Qualquer erro feito pela enzima polimerase durante o primeiro e o terceiro passo não estão sujeitos a leitura da prova, o resultado sendo uma pronunciada variabilidade na sequência”. Então, já em 1973, era concluido que o fenômeno acima “provará ser um obstáculo em bloco para qualquer análise genética de virus RNA de tumor”. (RNA de virus de tumor = retrovirus). Até hoje, os dados do genoma do HIV não tem alterado as previsões acima e mostram que muitos problemas podem existir com o uso dos estudos genomicos nos esforços de provar a infecção nos pacientes de AIDS com um único retrovirus exógeno, o HIV. Alguns destes problemas são resumidos abaixo: 1.Não existe dois genomas HIV que sejam os mesmos: (a) Não tem sido isolados dois HIV idênticos até mesmo da mesma pessoa. Em um caso onde dois isolamentos sequenciais foram realizados com uma diferença de 16 meses, nenhum dos provirus do primeiro isolamento foi encontrado no segundo levando um pesquisador do HIV a concluir “os dados implicam que não há uma coisa tal como um isolamento de um vírus da AIDS”; (b) Da mesma pessoa em um dado tempo mais de um HIV pode ser isolado; (c) Muitos, se não todos provirus detectados in vivo e in vitro, são defeituosos: (d) Em um e no mesmo paciente, os dados genômicos dos monócitos diferem daqueles nos linfócitos T; (e) Os dados genéticos obtidos in vitro não se correlacionam com os dados obtidos in vivo: “Cultivar é perturbar”; (f) O tipo de virus isolado é determinado pelos tipos de células usadas para o isolamento do HIV . 2. Não há correlação entre “isolamento” do HIV e detecção do genoma do HIV. Culturas positivas para “virus infecciosos” podem ser “reações em cadeia de polimerase negativas”. 3. As sequências do HIV não podem ser encontradas em todos pacientes de AIDS. Gallo e seus colegas resumindo os primeiros estudos de hibridização com tecidos frescos concluiram: “Temos anteriormente sido capazes de isolar o HTLV-III do sangue periférico ou tecido de linfonodo da maioria dos pacientes apresentando AIDS ou ARC.” [aproximadamente 50% dos pacientes referidos por Gallo]. “Contudo, como mostrado aqui, o DNA do HTLV-III geralmente não é detectado pela hibridização padrão do “Southern Blotting” destes mesmo tecidos e , quando acontecia de serem detectados, os resultados eram “pálidos”… o aumento do linfonodo geralmente encontrado em pacientes de ARC e AIDS não pode ser diretamente devido a proliferação das células infectadas pelo HTLV-III… a ausência de sequências detectáveis de HTLV-III no tecido de sarcoma de Kaposi de pacientes com AIDS sugere que este tumor não é induzido diretamente pela infecção de cada célula do tumor pelo HTLV-III… a observação que as sequências do HTLV-III sejam raramente encontradas, se o são, nas células mononucleares do sangue periférico, medula óssea e baço fornece a primeira evidência direta que estes tecidos não estão pesada ou amplamente infectados pelo HTLV-III seja na AIDS ou na ARC”. Estes estudos foram confirmados por outros pesquisadores. Para melhorar a detecção, o método da reação em cadeia de polimerase (PCR) foi introduzido. Contudo, “uma carecterística impressionante dos resultados obtidos até agora “com este método, como com a técnica padrão de hibridização” “é a escassez ou aparente ausência de DNA viral em uma proporção de pacientes” e, quando RNA viral ou DNA é encontrado, “o sinal” é muito baixo. Por exemplo, o HIV é pensado ser transmitido primariamente pelo intercurso sexual ainda que com o PCR o “genoma do HIV” possa ser detectado em uma minoria de amostras de sêmen (1/25). Deve ser ressaltado que um PCR positivo, até mesmo se encontrado em todos os pacientes – como é afirmado em algumas publicações – não pode ser visto como significativo da presença do inteiro genoma do HIV. Com a técnica da PCR “somente pequenas regiões podem ser amplficadas, um gene, na melhor das situações, isto é, não se pode detectar o genoma viral inteiro, e , já que a maioria dos “isolados de HIV’ até a presente data, são defeituosos, a detecção de parte ou de um gene inteiro, ou até mesmo vários genes, não pode ser considerado sinônimo do completo genoma do HIV. Sobretudo, a técnica PCR até esta data não é padronizada, tem havido apenas um estudo no qual a reprodutibilidade, sensibilidade e especificidade da PCR foram examinadas. Neste estudo, o padrão ouro utilizado foi o status sorológico. A especificidade foi determinada por medir a percentagem de resultados negativos na PCR nos pacientes soronegativos para o teste ELISA, indivíduos sadios, doadores de sangue, não incluidos em grupos de risco. Foi descoberto que a PCR não era reproduzível e que “resultados falso-positivos e falso-negativos foram observados em todos os laboratórios (a concordância com a sorologia variou entre 40% a 100%). Além disso, o número de resultados positivos no PCR não diferiram significativamente entre os soros negativos de baixo e alto risco”. 4. Resultados positivos de hibridização podem não ser específicos do HIV Em 1984 quando Gallo e seus associados realizaram seus primeiros estudos de hibridização, eles descobriram que quando os resultados eram positivos, as bandas de hibridização eram “pálidas”, de “sinal baixo”. O “sinal baixo” foi interpretado como uma prova de que os indivíduos infectados pelo HIV continham provirus em pequenos números nas células mononucleares do sangue periférico e um baixo número de cópias. Contudo, segundo Gallo e seus associados, “teoricamente esta intensidade baixa do sinal pode também ser explicadda pela presença de um vírus distantemente homólogo ao HTLV-III nesta células”. Os dados que vêm à luz desde então sugerem que esta possibilidade teórica pode ser um fato: (i) Embora não seja mais aceito que o HIV possa ser transmitido por insetos, em 1986 pesquisadores do Instituto Pasteur encontraram sequências de DN de HIV nas moscas tse tse, besouros negros e nos leões do Zaire e República Centro Africana. (ii) Em 1984 o grupo de Gallo relatou que o genoma do HIV se hibridiza com “genes estruturais (gag, pol, e env) de HTLV-I e de HTLV-II”. A evidência atualmente dispnível mostra que o DNA humano normal contém sequências genômicas retovirais relacionadas ao HTLV-I e II. (iii) Em 1985 Weiss e seus colegas relataram o isolamento, de culturas de células T mitogenicamente estimuladas de dois pacientes com uma variável comum de hipogamaglobulinemia, um retrovirus o qual “era claramente relacionado ao HTLV-III/LAV”; a evidência incluiu um WB positivo com soro da AIDS e hibridização com sondas do HIV. (iv) O DNA extraído de glândulas tireóide de pacientes com a doença de Grave hibridiza “com a região inteira da codificação de p24 gag” do HIV. (v) Horowitz et al, “descreve o primeiro relato da presença de sequências de nucleotídeo relacionadas ao HIV-1 em humanos, chimpanzés e DNA de macaco Rhesus de indivíduos normais não infectados”. Eles tem “demonstrado a presença de uma família complexa de sequências relacionadas ao HIV-1″ nas espécies acima, e concluiram que “análises posteriores de membros desta família ajudarão a determinar se tais sequências endógenas contribuiram para a evolução do HIV-1 via eventos de recombinação ou se estes elementos diretamente ou por meio de produtos de proteínas, influenciam a patogênese do HIV”. Que estes sinais positivos de hibridização podem ser devidos a tais eventos induzidos por agentes oxidantes [mutagenos e mitogenos] aos quais os grupos de risco da AIDS e as culturas são expostas é sugerido pelo seguinte: (a) um PCR positivo reverte para negativo quando a exposição aos fatores de risco é descontinuada ; (b) os monócitos de pacientes HIV+ nos quais pode ser detectado o DNA do HIV, até mesmo pela PCR, se tornam positivos para RNA do HIV depois do co cultivo com células T normais ativadas ConA”. Já em 1989 os pesquisadores do Instituto Pasteur concluiram que “a tarefa de definir a infecção pelo HIV em termos moleculares será difícil”. Eles confirmaram a conclusão deles em um estudo recente onde eles ” descreveram a enorme heteroigeneidade encontrada in vivo dentro das populações de HIV-1″ e a possibilidade “que um transportador HIV pode hospedar facilmente um excesso de 1.010 provirus, a maioria dos quais serão geneticamente únicos”. Eles concluiram: “É impossível portanto que o tamanho absoluto das variantes dentro de um indivíduo infectado permitirá que o HIV explore possibilidades genéticas totalmente novas”. O aparecimento de “estruturas retrovirais genéticas” radicalmente diferentes pode ser o resultado do “rearranjo, duplicação, deleção ou hipermutação. A transdução do DNA da célula hopedeira representa possivelmente o mais impressionante traço genético dos retrovirus”. Conclusão É axiomático que o uso de testes de anticorpos devam ser verificados em comparação com um padrão ouro. Os dados atualmente disponíveis falham em fornecer tal padrão ouro para os testes de anticorpos. A conclusão inescapável da discussão acima é que o uso dos testes de anticorpos para o HIV como ferramentas de predição, diagnóstica e epidemiológica para a infecção HIV necessita ser cuidadosamente reavaliada. Reconhecimentos Desejamos agradecer a todos nossos colegas e especialmente a Udo Schüklenk, Barry Page, Bruce Hedland-Thomas, David Causer, Richard Fox, John Peacock, David Prentice, Ronald Hirsch, Patricia Shalala, Keith Jones, Alun Dufty, June Rider Jones, Coronary Barrow, Dorothy Davis, Julian Smith, Mark Strahan, Vincent Turner, Wallace Turner e Graham Drabble por seu contínuo apoio e assistência. Dedicação Este trabalho é dedicado à memória de Methodios Papadopulos e Margaret Joan Turner.

My first post on this blog made this point: The central issue as to HIV/AIDS is whether HIV tests detect a viral infection. The day after I posted, I received a very informative e-mail from Darin Brown with useful detail about HIV tests.

I wrote on November 12 that it has never been shown that a positive “HIV test” corresponds to the presence of virus particles. That’s a hard fact to swallow, since the whole world seems to assume–at least, the whole official world and the mass media do–that a positive HIV-test indicates actual active and health-threatening infection. To make more believable that the conventional wisdom is wrong about this, let’s look more closely at how these tests were invented and what they really do.

Neville Hodgkinson (among others) has pointed out that the apparent correlation of AIDS with finding HIV antibodies (= a positive HIV test) is the result of a circular, illogical, and unjustifiable set of procedures and assumptions (“The circular reasoning scandal of HIV testing”, 21 May 2006, www.thebusinessonline.com):

Virus particles have not been isolated from AIDS patients, nor from the cultures in which their immune-system cells were stimulated in the attempt to grow the virus. But filtered material from these cultures contained “some 30 proteins . . . that gathered at a density characteristic of retroviruses” and some of these were assumed to come from HIV. Which ones? “They selected those that were most reactive with antibodies in blood samples from AIDS patients and those at risk of AIDS”! So “HIV” antigens (proteins) were not “identified” in relation to HIV itself– remember, pure particles of HIV have never been isolated; rather “HIV antigens” were chosen, defined, by their relation to antibodies occurring in AIDS patients. “AIDS patients are then diagnosed as being infected with HIV on the basis that they have antibodies which react with those same antigens. The reasoning is circular.”

There are two types of tests. The more recent and less frequently applied type uses the polymerase chain reaction, PCR, to look for bits of RNA or DNA said (but not proven) to be characteristic of HIV; the inventor of PCR, Kary Mullis, concurs with what the manufacturers of PCR tests say in their instructions: these tests cannot be used to diagnose infection by HIV. Hodgkinson’s comment applies to the more traditional tests which look for proteins said (but not proven) to be characteristic of HIV–the so-called ELISA and the so-called Western Blot tests. The accepted “best practice” is to use ELISA and to confirm a duplicated positive result by the Western Blot.

But the Western Blot is no better than the ELISA. It is anything but well defined or unambiguous.

“HIV” proteins are named by two properties, their molecular weight (for instance, p24) and the viral genes thought to code for their production (env, gag, pol). “Env” proteins include p160, p120, p41; “pol” comprise p68, p53, p32; “gag” have p55, p39, p24, p18.

A naïve lay person might assume that, since HIV tests are looking for actual virus, they would be looking to find all those proteins, moreover in the fixed proportion to one another, since that’s how they presumably occur in virus particles. The standard practice is grossly otherwise, however, quite shockingly otherwise: in different countries, and even in different laboratories in a given country, what is called a “positive” Western Blot may be pronounced upon finding only a few of these proteins!

Valendar Turner of the Perth Group has written detailed analyses of the Western Blot: “in Australia a positive test requires particular sets of four bands [one band per protein]. In the USA, different sets of two or three suffice, which may or may not include the bands required in Australia. In Africa only one designated set of two is required. Put simply, this means that the same person tested in three cities on the same day may or may not be HIV infected” (http://virusmyth.net/aids/data/vtyinyang.htm). In an affidavit for a law suit in Australia in 2006, Turner had this instructive diagram:

The naïve lay person might imagine, in line with ordinary common sense, that it would be enough to discredit the tests, that a person can be pronounced HIV-positive in one country but HIV-negative in another on the basis of tests with the same name. But this ambiguity also implies much more, namely, it raises the question whether these “HIV” proteins are even characteristic of HIV. Why does (for example) Australia require that four of the proteins be present? Because one or two of these supposedly “HIV specific” proteins are often found in perfectly healthy, “HIV-negative” people. So those one or two proteins are not specific to HIV, and finding them does not mean that lurking HIV has been detected. So, then: what research has shown that the presence of four of these proteins means that HIV has been lurking?

None! It has never been shown that one can isolate actual virus particles from samples “positive” by Western Blot. Anyway, the very fact that criteria are so different in different places shows that the choice of what to regard as a positive test is a matter of judgment, not of soundly based scientific knowledge. The fact that different criteria have resulted from the judgment of different experts indicates further that none of them represents objective science.

In any case, as said earlier, if actual virus particles were present, and their protein composition were what it is assumed to be, then all these proteins should be found in the same proportion. They are not. A positive Western Blot does not demonstrate the presence of virus.

Perhaps the most consequential corollary is this: so-called “HIV” proteins are often found in people not classed as infected by HIV. What do these proteins signify?

An analysis of the totality of HIV tests in the United States reveals that the probability of testing HIV-positive increases as there are more obvious challenges to health. People ill for any of many reasons are likely to have some of those “HIV” proteins in their blood and therefore to come up “positive” on an HIV test. The diagram below shows how the frequency of positive HIV-tests varies between different social groups. The progression from left to right corresponds to the likelihood that people in that group are experiencing a health challenge; it makes no sense in terms of the frequency of occurrence of a sexually transmitted infection.

 (from The Origins, Persistence and Failings of HIV/AIDS Theory, McFarland 2007)

A “positive HIV test” can therefore mean many different things, in terms of the actual substances that have been detected: anywhere from almost any two to almost any four of a set of ten proteins. Turner offers a nice analogy:
“. . . imagine this experiment. In place of the AIDS patient cell culture [with the proteins suspected to be from HIV] someone hands you a test tube containing milks obtained from half a dozen different animals. In other words, a mixture of several different proteins but you don’t know from which animals. Now in place of a mixture of antibodies from AIDS patients you obtain a second test tube containing a number of different acids. You add the mixture of acids to the mixture of milks and produce curdles [a positive finding]. Now you claim you’ve isolated [shown the presence of] a cow.”
The point is that a “positive” ELISA or Western Blot only shows the presence of some mixture of a few of those “HIV” proteins–some or all of which are also found at times in people certainly not infected by HIV. That’s why positive HIV-tests have been found in people with dozens of different conditions other than AIDS, see http://virusmyth.net/aids/data/cjtestfp.htm.
“HIV” tests do not detect HIV and they are not proof of infection by HIV.

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This is why HIV testing is dangerous to life and liberty. Dangers to life are these:

• A positive HIV test does not demonstrate active infection by a deadly virus.
• However: innumerable people have been incorrectly told, on the basis of these tests, that they are infected and that without antiretroviral treatment they will get AIDS and die.
• For those who immediately get treatment, the toxicity of the drugs is likely to produce death within a decade or so, and in the meantime the drugs often produce ghastly side-effects.
• Those judged not to need treatment yet are not really much better off. As soon as they become ill for any reason, no matter how minor–flu or diarrhea, say–this is likely to be taken as a sign that the HIV is starting to do its nasty work, and their toxic treatment regimen will begin.

But even without the physical dangers of antiretroviral treatment, the psychological impact of being told that one is HIV positive can be devastating. Testimonials to that–if any were needed–are legion. Imagine what it’s like to be told that you have a fatal and incurable illness. Imagine what it’s like, to be told that you have a sexually transmitted disease when you know that you have done nothing that makes contracting such an infection possible.
As to danger to liberty: Medical personnel have been accused of negligence, or incompetence, or evil intent, when patients under their care became “HIV positive”. The case of the Bulgarian nurses in Libya is the most notorious example, but there are instances from other countries as well, where doctors and nurses have lost their jobs because some patients became HIV positive.

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There will be many illustrations in later postings on this blog, of the damage done by the assumption that HIV tests detect HIV, as well as many illustrations of the most implausible claims being given credence just because the media and officialdom do not doubt that positive HIV tests denote infection by a virus.
For more about the lack of validity of HIV tests and the dreadful consequences of that, see for example the Perth Group; material collected on the website of the Alberta Reappraising AIDS Society and of HEAL Toronto; essays by Liam Scheff.